细胞周期蛋白E对乳腺癌细胞MCF-7生长及周期相关基因的影响

　　中华病理学杂志2000年第29卷第3期

　　黄玫　杨邵敏　廖松林　张波　由江峰

　　摘　要　目的　观察细胞周期蛋白（cyclin）E的表达对乳腺癌细胞MCF-7生长及其他周期相关基因的影响。方法　构建正义和反义cyclin e cDNA真核表达载体，并采用lipofect AMINE转染，将其导入MCF-7细胞，获得稳定表达正义及反义cyclin e的细胞系，经Southern和Western blot检测有外源性片段的插入及表达；并作细胞生长曲线、四甲基偶氮唑盐（MTT）法和流式细胞计数分析；用Western blot检测其他周期相关基因的表达。结果　cyclin E的高表达可以使细胞的生长速度加快(1.52倍)，DNA合成增加(4.2倍)，G₁-S期的移行加速，pRB的磷酸化形式增多(约为对照组的3倍)，但同时也上调p27的表达；而反义cyclin e则有相反的结果，降低cyclin E表达，并使细胞的生长减缓(抑制率为17.5%)，DNA合成下降(48.6%), g₁-S期移行减缓；同时pRB的低磷酸化形式增多，并下调p27。结论　cyclin e的表达可以影响乳腺癌MCF-7细胞的生长及增殖，并可能通过pRB的磷酸化而影响细胞周期G₁-S期移行，而实现其调节功能。

　　关键词：乳腺肿瘤；细胞周期蛋白质类；基因，CDC；转染；肿瘤细胞，培养的

　　细胞周期蛋白E( cyclin E )是G₁期重要的周期蛋白，与细胞周期蛋白质依赖激酶（cyclin dependent kinase 2，CDK2）结合促进pRB的磷酸化，并与增殖细胞核抗原（PCNA）及细胞周期蛋白质依赖激酶抑制因子（CKI）家族基因结合，促进细胞周期G₁-S移行的进程，加速细胞的生长、增殖^［1］。近年来发现，多种人类肿瘤有cyclin e基因的扩增和过度表达；cyclin E与乳腺癌的预后密切相关^［2］，可协同某些癌基因转化细胞和增强细胞的癌变倾向^［3］。为了直接探讨cyclin e的表达对人乳腺癌细胞的生长调控及对周期其他相关基因的影响，我们将正、反义cyclin e导入乳腺癌MCF-7细胞系中，对其细胞生物学行为及细胞周期相关基因表达的影响作了观察。

　　材料和方法

　　1.材料：pRC-cyclin E质粒由美国哈佛医学院Arnold博士赠送，lipofectAMINE，G418购自Gibco公司，HindⅢ，T4 dNA连接酶、小牛肠碱性磷酸酶、Wizard DNA质粒提纯试剂盒、RNA体外转录Riboprobe试剂盒购自Promega公司，cyclin e单克隆抗体购自Santa Cruz公司, cyclin D1、 pRB、p27单克隆抗体购自福州迈新公司。人乳腺癌细胞MCF-7由军事医学科学院陆应麟教授惠赠。

　　2.MCF-7细胞cyclin E表达载体模型的建立：（1）DNA重组：质粒扩增，酶切，DNA连接，大肠杆菌转化参见文献［4］。（2）基因转染：采用Lipofect-AMINE基因转染技术，具体方法参见厂家说明。转染48 h后换含1 000 μg/ml G418的完全培养基筛选阳性克隆，G418持续加压3周。获得转化细胞系分别命名为MCF-7-cyclin e-s（正义），MCF-7-cyclin E-as（反义）和MCF-7-pcDNA3（空载体）。

　　3.Southern blot检测目的基因: 提取基因组DNA 20 μg，按3 μl/μg dNA的量加入限制性内切酶HindⅢ,反应总体积为300～400 μl, 37℃温育12 h。以α-³²P标记的1.5 kb cyclin E cDNA片段为探针（Promega公司DNA随机引物标记试剂盒标记）。Southern印迹及杂交方法按常规方法进行。

　　4.蛋白质免疫印迹检测:培养细胞用PBS缓冲液洗2遍，用自制细胞刮子收集细胞，加入悬浮缓冲液混匀，加等体积的2×十二烷基硫磺酸钠（SDS）上样缓冲液，冰浴30 min，沸水中10 min，10 000 r/min离心 10 min，收集上清。用Lowry法测定蛋白浓度。每个泳道上样量为100μg。抗体的浓度分别为cyclin E 1∶100、 cyclin D1 1∶20、pRB 1∶100、 p27 1∶20。

　　5.检测cyclin E基因转染对MCF-7细胞体外生长特性的影响^［4，5］：（1）于25 ml培养瓶内接种1×10⁵个对数生长期的细胞，每日计数3瓶细胞，连续8 d，绘制其生长曲线。（2）³H-TdR掺入:于96孔板内接种7.5×10³个对数生长期的细胞，孵育箱中培养18 h时后取出，每孔加入18.5 TBq³H-TdR，继续培养6 h，收集细胞于玻璃纤维膜上，测定cpm值。（3）四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定:接种细胞数同³H-TdR掺入，孵育箱培养24 h后取出，每孔加入10 μl MTT(终浓度5 mg/ml)，继续培养4 h，见针状结晶形成，加入200μl 二甲基亚砜（DMSO），测570 nm时吸光度（A，曾称光密度OD）值。观察细胞存活情况。（4）软琼脂集落形成：于6孔板内将下层1.2%低熔点琼脂糖与2×DMEM培养基、上层0.7%低熔点琼脂糖与2×DMEM以1∶1混合，内含细胞600个，CO₂孵箱内培养10 d。

　　6.流式细胞仪分析：取对数生长期的MCF-7细胞，按常规方法收集细胞，固定后于FACScan流式细胞仪(BecTonDICKINSON公司)上检测。

　　7.统计学处理：样本均数间差异用t检验，周期分布组间差异用χ²检验。

　　结果

　　1．MCF-7细胞cyclin E表达模型的建立：（1）用HindⅢ将1.5 kb的cyclin E cDNA片段从质粒pRC-cyclin E上切下，克隆到pcDNA3中的HindⅢ位点，经PstⅠ及Bam HI双酶切鉴定筛选得到含正义及反义cyclin e cDNA 质粒，分别命名为pcDNA3-cyclin E-s和pcDNA3-cyclin E-as，见图1，2。（2）鉴定转染细胞克隆株：Southern blot 基因组DNA经HindⅢ酶切后，转膜后杂交，各组均可见一条5 kb左右的条带，而转染正义及反义组另见一1.5 kb的条带，为外源性插入片段，证明外源基因已整合于细胞染色体中，见图3。Western blot分析转染后cyclin E表达水平，得到cyclin E高、低表达的克隆各1个，见图4。

图1　重组质粒图

1：λDNA HindⅢ标记物，2：cyclin E质粒，3：正义PstⅠ酶切，4：正义Bam HI酶切，5：反义Bam HI酶切，6：反义PstⅠ酶切，7：cyclin e质粒，8：λDNA HindⅢ标记物图2　重组质粒鉴定电泳结果

　　2. cyclin E基因转染对MCF-7细胞体外生长特性的影响：生长速度测定表明，MCF-7-cyclin e-s细胞较对照组MCF-7-pcDNA3快，约为对照组的1.52倍。同样³H-TdR掺入率明显增高，是对照组细胞的4.2倍。MTT测定显示，MCF-7-cyclin e-s细胞的增殖及代谢能力是对照细胞的1.43倍，经检验P＜0.05。而MCF-7-cyclin e-as细胞的生长较对照组明显减慢，生长抑制率达17.5%；³H-TdR掺入率降低，仅为对照的48.1%。MTT显示其生长抑制率为18.4%，P均＜0.05，结果见图5，表1。说明cyclin e的高表达促进细胞生长及DNA合成，而反义cyclin E则降低细胞增殖，抑制DNA复制。软琼脂集落形成实验中，MCF-7-cyclin e-as所形成的集落较MCF-7-cyclin E-s少，而较MCF-7-pcDNA3多，但经统计学检验差别无显著性意义（表1）。

1：空载体，2：正义，3：反义图3　转染细胞Southern杂交结果

1：空载体，2：正义，3：反义图4　Western blot检测cyclin E结果

表1　³H-TdR掺入值，MTTA值，周期分布及软琼脂集落形成情况

细胞	3　H-TdR 　　掺入值	MTTA值	周期分布(%)			软琼脂集落 　　形成率
	(cpm，%， ±s)	(±s)	G1	S	G2+ 　　M	(%，±s)
MCF-7- 　　pcDNA3	2 013± 　　247	0.174± 　　0.001	63.3	31.5	5.1	205.3± 　　20.4△
MCF-7- 　　cyclin 　　E-s	8 526± 　　485*	0.248± 　　0.009*	55.4	38.3	6.3	271.6± 　　17.0△
MCF-7- 　　cyclin 　　E-as	969± 　　27*	0.142± 　　0.002*	69.5	21.8	8.7	243.7± 　　11.0

　　注：3个细胞系，重复2次，每次3个孔，共6次，^*P＜0.05，^△P＞0.05

图5　MCF-7细胞生长曲线

　　3.细胞周期的改变(表1)：(1)分析表明，停滞于G₁期的MCF-7-cyclin e-as细胞(69.5%)较MCF-7-pcDNA3(63.3%)多，而MCF-7-cyclin E-s细胞(55.4%)则较MCF-7-pcDNA3细胞(63.3%)少，S期细胞相应增多。说明 cyclin E的高表达促进G₁到S期的移行，而低表达则抑制这种过渡，但差异无显著性（χ²=7.059，P＞0.05）。(2)Cyclin e基因表达对 pRB, p27, cyclin D1蛋白水平的影响：如图6所示，对照组有pRB的表达，当转入cyclin e后，pRB的表达状态及量均受cyclin E表达水平的影响。具体表现为cyclin e表达增高时pRB高磷酸化(ppRB)的状态明显增多(即泳动较慢的条带)，大约是对照组的3倍；而cyclin e表达状态降低时失活状态的非磷酸化的状态增多，而高磷酸化状态略有减少。p27的表达则随着cyclin e的增高或降低而升高或降低(图7)。cyclin D1的表达未见明显的改变，（图8）。

图6　Western blot检测

　　pRB的表达结果

图7　Western blot检测p27的表达结果

图8　cyclin D1的Western blot检测结果

　　讨论

　　在多种肿瘤中cyclin E有基因扩增及过表达，与乳腺癌的预后关系密切^［2］；并与ras共同使鼠纤维母细胞发生恶性转化^［3］；转基因鼠可以引起细胞的异常增殖及乳腺癌的发生^［6］；cyclin　E高表达可加速G₁期进程^［7］，并可逆转p27引起的G₁期阻滞^［8］。这些都表明cyclin　E可以促进细胞的生长，增殖，并可能通过调节G₁期和S期的移行而发挥作用。在本研究中，导入正义cyclin　E后MCF-7细胞生长速度、DNA合成及细胞增殖和代谢的能力均明显上升。与此相对应的是G₁期细胞数目减少，S期细胞增加。导入反义cyclin　E后细胞生长速度、DNA合成及细胞增殖和代谢的能力均下降，G₁期细胞数目增多，S期细胞减少。这一结果与以往研究一致，表明cyclin e的高表达促进细胞的生长，而降低cyclin E可以部分延缓细胞的增殖。但是在软琼脂集落形成实验中，cyclin　E的表达未能显著影响细胞的停泊依赖性生长，这也可解释cyclin　E尚不能使细胞获得完全性自主生长^［3］。

　　周期蛋白E是G₁期重要的周期蛋白，它与CDK2形成复合物，促进pRB磷酸化^［9］。实验也同样显示 cyclin E的高表达使pRB磷酸化的形式明显增多，大约是对照组的3倍；而cyclin　E的低表达则使pRB的低磷酸化形式增多。说明cyclinE通过对pRB的磷酸化作用影响细胞的生长及周期的进程。

　　p27为周期蛋白/CDKs复合物的抑制剂，因而抑制细胞周期的演进。但本研究显示cyclin　E与p27的表达有一致性，这与cyclin　D1与p27的表达的相关性相似：在8个食管癌细胞系中cyclin　D1与p27的表达有明显的正相关，并且cyclin　D1的转染可增强p27的表达^［10］。Pagano m等^［11］认为，可能在部分细胞中pRB、cyclin　D1和p27之间存在一个稳态正反馈调节通路，并可能与泛素-蛋白酶路径参与p27蛋白的降解有关。

　　有研究显示cyclin　D1可促进cyclin E基因的表达，因其激活子上存在一个与E2F结合的位点^［12］，当高表达cyclin d1时促进pRB的失活，解离出的E2F与cyclin E的启动子结合，因而活化cyclin e基因。在本实验中，cyclin　E基因转染对cyclin　D1未见明显影响。可能两者的作用是单向的，或与实验用细胞系有关。

　　我们通过基因转染直接观察了cyclin　E基因表达对癌生物学特性的影响，表明上调cyclin　E可以通过对pRB的磷酸化的调节而影响细胞周期的进程，从而调节细胞的生长和增殖；并可同时影响p27基因状态。这对于阐明cyclin　E基因表达与乳腺癌细胞生物学特性的关系有一定的帮助。

　　作者单位：黄玫(100083 北京医科大学病理学系)

　　杨邵敏(100083 北京医科大学病理学系)

　　通信作者：杨邵敏、廖松林

　　参考文献

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