乳腺癌患者MRP基因表达及临床意义

中国肿瘤临床 2000年第1期第27卷 论著

作者：唐利立　刘少华　蹇在伏　陈方平　海健　解勤之　费慧娟

单位：唐利立（湖南医科大学湘雅医院肿瘤科　长沙市410008）；刘少华（湖南医科大学湘雅医院肿瘤科　长沙市410008）；蹇在伏（血液研究室）；陈方平（血液研究室）；海健（湖南医科大学湘雅医院肿瘤科　长沙市410008）；解勤之（血液研究室）；费慧娟（湖南医科大学湘雅医院肿瘤科　长沙市410008）

关键词：乳腺癌MRP（多药耐药相关蛋白）新辅助化疗多药耐药

　　摘要目的：检测MRP基因在人乳腺癌组织中的表达状况，初步分析其临床意义。方法：37例待手术乳腺癌患者随机分为直接手术、术前化疗、术前化疗加三苯氧胺三组。采用RT－PCR法检测癌组织中MRP基因表达。结果：术前化疗组MRP阳性率28.6％(6/21)；直接手术组MRP极弱或无表达(0/8)；(P＜0.01)；加用三苯氧胺MRP表达减少为1/8。局部晚期病例MRP基因表达多呈阳性(5/9)。结论：以上结果提示MRP是乳腺癌MDR产生的机制之一；MRP基因表达与乳腺癌的发展有关，可能是乳腺癌的重要预后指标。

　　MRP Expression in Primary Breast Carcinoma and Its Clinical Significance

Tang Lili　Liu Shao　hua Jian　Zaifu et al

　　（Department of Oncology, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha）

　　Abstract Purpose: This research is to investigate the expression of multidrug resistance associated protein (MRP)in primary breast carcinoma and to evaluate its clinical signification. Methods: The expression of MRP in 37 cases of breast carcinoma were assayed by RT－ PCR. Eight patients were not treated with chemotherapy before operation, 21 patients were treated with chemotherapy, the other 8 patients were treated by chemotherapy plus Tamoxifen. Results: The expression of MRP in patients treated with chemotherapy was higher (6/21) than that of untreated patients (0/8), P＜ 0.01. The overexpression of MRP appeared in most patients who had local advanced breast cancer (5/9), P＜ 0.05. Conclusion: These results suggest that MRP gene expression in breast cancer is most likely induced by chemotherapy and that it is associated with progress of breast cancer.

　　Key Words Breast neoplasm MRP Neoadjuvant chemotherapy Multidrug resistance

　　以手术为主辅助化疗、放疗等综合治疗措施，使乳腺癌的疗效有所提高。但体内残存微小病灶对化疗药物的多药耐药性及辅助化疗对象的确定，仍是临床急待解决的问题。本文采用逆转录多聚酶链反应(RT－PCR)方法，检测37例术前不同处理组原发乳腺癌患者癌组织多药耐药相关蛋白(mltidrug resistance－associated protein,MRP)^[1]基因表达，并初步分析其临床意义。

　　1　材料与方法

　　1.1病例资料

　　37例均为本科室诊断为原发性乳腺癌待手术的女性患者，年龄28～70岁，中位年龄43岁。直接手术8例；术前化疗(CMF方案2～3次或CAF2个周期)21例；术前化疗（方案同上）加三苯氧胺（Tamoxifen,TAM）8例。37例均经病理证实为乳腺癌。术中留取新鲜瘤组织，保存于－80℃冰箱。

　　1.2细胞总RNA提取^[2]

　　将瘤组织制成细胞悬液，生理盐水离心清洗后，用RNA试剂盒（美国QIAGEN公司）提取RNA，操作按说明书。

　　1.3逆转录

　　反应体系20μl，内含RNA10μg，反转录酶M－MULV(BM公司)20U，dNTP(华美）200μmol/L,RNA酶抑制剂（BM公司）25U，随机引物（BM公司）100ng，5x缓冲液4μl，42℃反应1小时。

　　1.4MRP引物序列

　　见文献^[3]，为美国OPERON公司合成。内对照三磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde－3－phosphatedehydrogenase,GAPDH)^[4]引物由本院胡成平博士惠赠。

　　1.5PCR扩增

　　反应体系50μl，包括逆转录产物5μl，dNTP200μmol/L,引物50pmol/L，Taq酶（BM公司）2U,10×PCR缓冲液5μl。扩增条件：94℃5分钟热启动后，94℃30秒，55℃60秒，72℃70秒，扩增30周期，然后72℃延长10分钟，4℃终止反应。整个过程均在美国产PE－480PCR仪中进行。

　　1.6PCR产物定量

　　取10μl扩增产物在2％的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下照像，全自动光密度扫描仪（BEKMAN）扫描，计算MRP/GAPDH值，以比值≥1定为过度表达^[4]。

　　1.7体外药敏试验

　　采用MTT比色法^[5]。ER检测采用ER－ICA方法，由美国Abbott实验室提供药盒。

　　1.8统计学处理

　　各组间MRP过度表达（阳性）率显著性差别，用四格表直接计算概率法。

　　2　结果

　　2.1乳腺癌组织MRP的表达

　　所有标本均可见内参标准GAPDH带(661bp)^[6]。直接手术组MRP表达极低或不表达。术前化疗组MRP表达阳性率为28.6％(6/21)。化疗＋TAM组为12.5％(1/8)，见附图，表1。

　　2.2MRP表达与临床分期、ER及病理类型的关系

　　37例患者属局部晚期共9例，MRP阳性率为55.6％(5/9)，Ⅰ、Ⅱ期患者共28例，MRP阳性率为7.1％(2/28)，两者有显著性差异(P＜0.05)。受体检测表明MRP阳性者ER多为阴性(5/7)，见表2。

　　2.3MRP表达与体外药敏结果的关系

　　37例患者中28例行体外药敏试验。结果表明：MRP阳性与VCR、ADM耐药的符合率分别为85.7％(6/7)，42.9％(3/7)，MRP阴性的符合率分别为52.4％(11/21)，23.8％(5/21)。

附图　MRP琼脂糖电泳图

Lane1:Marken;Lane2、3、6、8:为术前化疗组乳腺癌标本;

　　Lane4:直接手术组标本;Lane5、7:术前化疗加TAM组标本。

　　各组均可见内参标准带(661bp)

表1　术前化疗对人乳腺癌MRP基因表达的影响

　　＊与直接手术组比＊＊与术前化疗组比较

表2　MRP基因表达与乳腺癌临床分期及ER的关系

　　＊与Ⅰ～Ⅱ期MRP表达阳性的百分率相比

　　＊＊与ER＋的百分率比较

　　3　讨论

　　肿瘤多药耐药发生机制复杂，目前认为主要有以下几方面^[7]:1)MDR1/P－gp。即MDR1基因过度表达，产生高分子量(170KD)膜相关糖蛋白；2)MRP(multidrug resistance－associated protein)和LRP(lung resistance－related protein)基因表达；3)DNA拓扑异构酶的改变；4)谷胱甘肽转移酶系统含量增加、活性增强。其作用机理可能包括药物的解毒，药物靶位点及转运蛋白的改变^[8]。MRP是分子量190KD与ATP结合的膜糖蛋白，有报道MRP可将化疗药物泵出细胞^[9]。我们的结果显示，术前化疗的乳腺癌组织MRP表达阳性率升高，且与体外药敏VCR耐药密切相关，说明MRP在乳腺癌MDR中起重要作用。MRP阳性多为晚期病例，提示MRP表达与乳腺癌的发展有关，笔者在连续观察过程中已有两例有远处转移。Filipitis等(1996)曾报道MRP染色强度与乳腺癌肿瘤大小相关^[10]，最近Kees(1997)等发现在复发乳腺癌患者组织中MRP表达阳性率增加^[11]。均说明MRP表达可能与乳腺癌进展有关，MRP可能是乳腺癌预后的重要指标之一，其在辅助化疗方案的制定中有一定的意义。TAM在逆转MDR中的作用也有报道，但机制未十分明了。本组结果显示：合用TAM癌组织MRP表达阳性率有下降趋势，扩大病例进一步探讨及长期疗效的观察尚待继续完成。

　　参考文献

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　　5，Xie K,Huang S,Dong Z,et al. Direct correlation between expression of endogenous inducible nitric oxide synthase and regression of M5076 reticulum cell sarcoma hepatic metastases in mice treated with liposomers containing lipopeptide CGP 31362. Cancer Res,1959;55(14):3123～ 31

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　　8，Volm M,Mattern J. Resistance mechanisms and their regulation in lung cancer. Crit Rev Oncogenesis,1996;7:227～ 44

　　9，Zaman GJ,Flens MJ,Van Leusden MR. The human multidrug resistance－ associated protein MRP is a plasma membrane drug－ efflux pump. Proc Natl Acad Sci USA,1994;91:8822～ 6

　　10，Filipitis M,Suchomel RW,Dekan G,et al. MRP and MDR1 gene expression in primary breast carcinomas. Clin Cancer Res,1996;2:1231～ 7

　　11，Nooter K,de la Riviere GB,Klijn J,et al. Multidrug resistance protein in recurrent breast cancer. Lancet,1997;349(9069):1885～ 6

收稿1999－03－27