外周血干细胞移植联合大剂量化疗治疗21例乳腺癌的初步观察

中国肿瘤临床 2000年第2期第27卷 论著

作者：郝希山　邵莹　佟仲生　崔秀珍　任秀宝　任宝柱　宁连胜　方志沂　李云英　张谨　李丽庆

单位：郝希山（天津医科大学附属肿瘤医院 天津市300060）；邵莹（天津医科大学附属肿瘤医院免疫室 天津市300060）；佟仲生（天津医科大学附属肿瘤医院化疗科 天津市300060）；崔秀珍（天津医科大学附属肿瘤医院 化疗科天津市300060）；任秀宝（天津医科大学附属肿瘤医院免疫室 天津市300060）；任宝柱（天津医科大学附属肿瘤医院免疫室 天津市300060）

关键词：自体外周血造血干细胞移植(APBSCT)；乳腺癌；大剂量化疗

　　摘要　目的：研究自体外周血造血干细胞移植(APBSCT)支持下的大剂量化疗，治疗伴有高危复发因素的乳腺癌和转移性乳腺癌的效果。方法：选择21例高危(区域阳性淋巴结LN≥10个)或转移性乳腺癌患者，采用环磷酰胺＋阿霉素＋氟脲嘧啶(CAF)为常规化疗动员方案，联合粒细胞刺激因子＋粒巨细胞刺激因子(G/GM－CSF)动员方案，应用血细胞分离机CS－3000plus(美国Baxter)采集患者自体外周血造血干细胞，程控冷冻降温系统－196℃保存干细胞，RT－PCR方法检测采集的造血干细胞(富集血)中残存病灶上皮性粘蛋白(MUC－1)和角蛋白(K19)的表达，预处理方案环磷酰胺CTX60mg/kg/d×2＋卡铂CBP800～1000mg/m²/d×1＋VP－16300mg/m²/d×2，全环境护理直至造血功能重建。结果：本动员方案具有较好的动员效果，大多数病例采集两次即可获得足够的干细胞。第一次采集即能得到45％的单个核细胞(MNC)及50％的粒细胞克隆形成单位(CFU－GM)。MNC、CFU－GM及爆式红细胞形成单位(BFU－E)的回收率分别为80％、74％、71％。造血重建较快，中性粒细胞≥0.5×10⁹/L的时间为11.8±1.65天。血小板≥50×10⁹/L的时间为14.86±1.55天。回输CFU－GM最低者为0.67×10⁵/kg，但其造血重建时间并未延长。15例乳腺癌患者中11例高危患者至今均无病生存(DFS)，最长者已27个月。而3例转移性乳腺癌患者有1例无病生存，2例仍带病生存(DCS)。无移植相关死亡。结论：APBSCT支持下的大剂量化疗治疗方法安全可靠，CAF＋G/GM－CSF动员造血干细胞方法效率高，RT－PCR检测MUC1和K19是一种灵敏度较高和特异性较强的检测乳腺癌残存病灶的方法，程控冷冻系统保存干细胞稳定安全，APBSCT支持下的大剂量化疗治疗高危性和转移性乳腺癌近期疗效较好，远期疗效需等待进一步观察结果。

An Analysis of High Dose Chemotherapy Supported by Peripheral Blood Stem Cell Transplantation for 21 Cases of Advanced Breast Cancer

Hao Xishan Shao Ying Tong Zhongsheng et al(Tianjin Cancer Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin)

　　Abstract Purpose: To evaluate the effect of high dose chemotherapy supported by peripheral blood stem cell transplantation for high risk recurrent and metastatic breast cancer patients.Methods: Twenty－ one cases of high risk (regional positive lymph node≥ 10) or metastatic breast cancer patients were selected. The mobilization plan was CAF＋ G/GM－ CSF (cyclophosphamide 600～ 800mg/m², adriamycin 30～ 40mg/m², 5－ fluorouracil 300mg/m², G/GM－ CSF 10ug/kg/d). : To evaluate the effect of high dose chemotherapy supported by peripheral blood stem cell transplantation for high risk recurrent and metastatic breast cancer patients.Methods: Twenty－ one cases of high risk (regional positive lymph node≥ 10) or metastatic breast cancer patients were selected. The mobilization plan was CAF＋ G/GM－ CSF (cyclophosphamide 600～ 800mg/m², adriamycin 30～ 40mg/m², 5－ fluorouracil 300mg/m², G/GM－ CSF 10ug/kg/d). The auto－ peripheral blood stem cells were collected by CS－ 3 000plus and frozen by programmed cryopreservation system. The residues of breast cancer cells were determined by RT－ PCR method for MUC－ 1 and K－ 19 expression. High dose chemotherapy consisterd of CTX 60mg/kg/day× 2, CBP 900mg/m²/day× 1, VP－ 16 600mg/m²/day× 2. Patients lived in a highly efficient participate air filtered room until to reconsitute the hematopoietic function.Results:The hematopoietic stem cell mobilization was effective in all patients. Two times collection was enough in most patients. 45％ MNC and 50％ CFU－ GM were obtained in the first collection. The recovery rates of MNC, CFU－ GM, BFU－ E were 80％ , 74％ and 71％ respectively. The hematopoietic reconstitution was established quickly, the mean time of reconstitution of neutrophilic granulocytes≥ 0.5× 10 /L was 11.8＋ 1.65 days and blood platelet＞50× 10⁹/L 14.86＋ 1.55 days. The lowest volume of CFU－ GM returning to patients was 0.67× 10⁵/kg, but the time of hematopoietic function reconstitution was not prolonged. The FDS of 11 cases of high risk breast cancer patients remained and the longest survival time was 27 months. One of three cases of metastatic breast cancer was FDS and other 2 cases were CDS. There was no transplantation related death.Conclusion: High dose chemotherapy supported by auto－ peripheral blood stem cell transplantation for high risk and metastatic breast cancer patient is safe and efficiency. Highly effective mobilization can be obtained by CAF＋ G/GM－ CSF. The RT－ PCR method for determing the residues of breast cancer is sensitive and distinctive. The short－ term therapeutic effect of this scheme is efficient and the long－ term effect will be awaited for further observation.

　　Key Words　APBSCT 　Breast cancer 　High dose chemotherapy

　　自体外周血造血干细胞移植(APBSCT)联合大剂量化疗治疗乳腺癌是当今一种新技术。大剂量化疗(HDC)和干细胞移植(PCT)技术的产生起源于药物剂量和疗效有相关性的概念。1964年Skipper^[1]首次提出了抗癌药物的剂量问题，Frie等^[2]在实验室里得出了剂量依赖曲线，1984年Hryniuk等^[3]首次报道了化疗药剂量与疗效有相关性的临床观察结果。80年代医学技术飞速发展，干细胞冷冻保存技术和基因重组造血因子技术获得了成功，大剂量化疗和干细胞移植技术首次用在白血病的治疗，使一些难治性白血病得到了治愈的机会。1981年^[4]首次报道在转移性乳腺癌治疗的应用。1986年^[5]首次报道外周血干细胞移植治疗实体瘤。1991年重组造血因子被批准进入医药商业市场，1989年时约有600例乳腺癌接受了HDC＋PCT^[6]，1995后美国骨髓移植登记中心每年超过3800例，其中乳腺癌超过1700例。1995年时外周血干细胞移植与骨髓移植(PBSCT/BM)比例为7.2:1^[7]。

　　目前化疗在乳腺癌治疗中的作用越来越突出，尽管常规化疗在治疗乳腺癌中占有重要位置，但伴高危复发因素的乳腺癌(转移性淋巴结阳性大于10个)和转移性乳腺癌预后没有明显改善，高危复发因素的乳腺癌5年复发率55％～57％，10年复发率70％～90％，5年常规化疗生存率45.5％^[8]，10年无病生存率(DFS)为15％～20％^[9]。转移性乳腺癌平均生存期为2年。由于外周血干细胞移植支持下的大剂量化疗技术已日趋完善，目前成为治疗乳腺癌，特别是高危复发及转移性乳腺癌的重要手段。我国自1994年引进PBSCT技术用于实体肿瘤的治疗，我院1991年开始乳腺癌的骨髓移植BMT，1996年开始APBSCT治疗乳腺癌。目前有关乳腺癌APBSCT国内尚未见报道。本文通过对21例伴高危复发因素和转移性乳腺癌患者APBSCT联合大剂量化疗的临床研究资料的分析，对该方法进行初步评价。

　　1　材料与方法

　　1.1　病例选择

　　所有患者均为高危复发(区域LN≥10个阳性)或转移性乳腺癌患者，详细材料见表1。

表1　乳腺癌干细胞移植病例情况

　　＊乳腺癌手术标本引流区转移淋巴结数

　　1.2　动员方案

　　入选患者在术后接受常规化疗CAF＋G/GM－CSF动员方案。当患者行常规化疗后，检测WBC变化，约10～14天时WBC由最低值开始回升时皮下注射惠尔血(G－CSF)及升白能(GM－CSF)，直至采集结束，一般约3～5天。

　　常规化疗方案：环磷酰胺(C)600～800mg/m^2.·d1，阿霉素(A)30～40mg/m^2.·d1，氟脲嘧啶(F)300mg/m^2.·d1～d5。

　　造血因子用法：G－FCS5μg/kg·diH，GM－CSF5μg/kg·diH。

　　1.3　外周血造血干细胞采集

　　干细胞采集应用CS－3000plus(美国Baxter)血外周血干细胞移植联合大剂量化疗治疗21例乳腺癌的初步观察例数采集次数细胞分离机，一般经双上肢静脉与机器之间建立封闭循环，部分患者采用锁上静脉双腔管循环。采集程序为单个核细胞采集程序。循环时间3～4小时，流速55ml/分钟，循环总量10升/次。

　　1.4　干细胞冷冻、保存

　　采用程控冷冻降温系统(美国Forma公司)将采集的干细胞以每分钟降1℃的速度，降至－80℃后保存于－196℃液氮中，其中冷冻保存液为70％TC－199，20％DMSO，10％AB血清。干细胞浓度为107/ml，体积60ml/袋。

　　1.5　干细胞各项指标检测方法

　　MNC检测采用胎盘蓝拒染法，CFU－GM，BFU－E采用半固体培养法。

　　1.6　残存病灶检测

　　本实验采用PT－PCR法对移植患者的富集血MUC1及K19mRNA的表达进行测定。

　　1.7　预处理方案

　　入选患者经2～3轮常规化疗后，进入层流病房，药浴后给予大剂量化疗，方案如下：CTX60mg/kg·d×2，CBP800～1000mg/m^2.·d×1，VP－16300mg/m^2.·d×2。

　　1.8　造血干细胞的回输

　　预处理结束后48小时回输造血干细胞，将冷冻保存在－196℃液氮中的造血干细胞冷冻袋放置42℃水浴中，快速解冻，立即经静脉无过滤回输，10分钟内输完。

　　1.9　造血功能重建的临床观察

　　患者进层流病房后，每日观察血象，当中性粒细胞＞0.5×10⁹/L，血小板＞50×10⁹/L时，视为造血功能重建成功，患者可出层流病房。

　　2　结果

　　2.1　病例情况

　　见表1。

　　2.2　动员效果分析

　　表2结果表明：采用本动员方案具有较好的动员效果。大多数病例采集两次即可获得足够的干细胞。第一次采集即能得到45％的MNC及50％的CFU－GM。

表2　CAF＋G/GM动员采集效果分析

　　2.3　程控冷冻对造血干细胞的影响

　　应用程控冷冻系统－196℃冻存干细胞，MNC、CFU－GM及BFU－E的回收率分别为：80％，74％，71％，提示该方法安全可靠，见表3。

表3　干细胞冷冻回收率

　　2.4残存病灶检测结果

　　用RT－PCTR方法检测MUC－1＋K19基因在富集血中的表达，结果显示灵敏度为10万分之1，在15例富集血中2例表达阳性(详细资料见中国肿瘤临床1999年第26卷第10期725～727)。

　　2.5　造血干细胞移植与造血功能重建的关系

　　表4提示所有患者造血重建较快，干细胞回输后中性粒细胞≥0.5×10⁹/L的时间为11.8±1.65天。血小板≥50×10⁹/L的时间为14.86±1.55天。虽然其中回输CFU－GM最低者为0.67×105kg，但其造血重建时间并未延长。

表4　造血干细胞移植与造血功能重建的时间关系

　　2.6　治疗及随访结果

　　表5提示15例乳腺癌患者中11例高危患者至今均无病生存(DFS)，最长者已27个月，而3例转移性乳腺癌患者有1例无病生存19个月，2例仍带病生存(DCS)。

表5　疗效观察

　　2.7大剂量化疗的毒副作用

　　表6提示患者经大剂量化疗后，多数出现恶心，呕吐，发热反应，所有患者均无严重功能损害，提示患者可耐受预处理方案。

表6　高危乳腺癌造血干细胞移植后的急性不良反应

　　3　讨论

　　自80年代有人开始应用骨髓移植联合大剂量化疗治疗实体瘤获得成功以来，造血干细胞移植在实体瘤，特别是乳腺癌治疗方面发展很快，尤其是随着自体外周血干细胞动员、采集、冻存等技术的发展，以APBSCT联合大剂量化疗用于乳腺癌治疗的病例数俱增，根据美国骨髓移植登记处的资料从1989～1995年移植的近2万患者中，乳腺癌病例数占5886例。APBSCT以每年20％速度递增，至1995年乳腺癌患者行APBSCT者占总移植病例的72％。在治疗高危及转移性乳腺癌中，其疗效各家报道不一。Peter等人在用HDC＋APBSCT治疗60例腋窝淋巴结10个以上阳性的乳腺癌患者时，其5年无病生存率为68％^[10]，而常规化疗治疗这类患者大约有50％～70％要在5年内复发^[8]。我国在应用HDC＋APBSCT治疗乳腺癌方面的研究尚属萌芽阶段，至今尚无报道。本研究通过对21例高危及转移性乳腺癌行HDC＋APBSCT治疗的结果进行了初步观察，结果显示在APBSCT支持下，患者均能耐受大剂量化疗，全部高危患者至今均无病生存(最长者已27个月)。其中1例转移性患者行APBSCT之前经数个疗程化疗后只能达PR，而在该方法治疗后达CR，因此我们推测该方法治疗后乳腺癌有较好的近期疗效，长期疗效还需进一步随访。本研究在治疗过程中无相关死亡，并发症有恶心，呕吐，腹泻，发热，患者均可耐受。

　　另外，国外对干细胞的动员通常应用大剂量化疗联合G/GM－CSF^[11]，我们在实际工作中发现大剂量化疗动员干细胞不仅毒副作用大，且骨髓抑制时间长。本结果表明，应用常规化疗联合G－CSF和GM－CSF动员效果较好，通常动员后采集2次即可获得足够的PBSC，第1次采集可获得平均45％的89外周血干细胞移植联合大剂量化疗治疗21例乳腺癌的初步观察MNC和50％的CFU－GM，第2次采集可获得42％的MNC和38％CFU－GM，说明再次采集时克隆形成单位细胞下降24％，而单个核细胞变化不大。移植后造血重建亦较快，平均中性粒细胞≥0.5×10⁹/L时间为11.8±1.65天，血小板≥50×10⁹/L时间为14.86±1.55天。由于外周血干细胞富集血中是否残留肿瘤细胞直接影响患者的预后，国外大多应用PT－PCR方法测定K19mRNA来预测残存肿瘤细胞。本研究则应用PT－PCR技术对MUC1及K19两种基因联合检测，证实其灵敏度(十万分之一)及特异性均高。15例患者富集血中有2例阳性，阳性表达结果和移植后复发的关系目前尚不能评价，有待于积累病例后再做分析。造血干细胞程控冷冻后回收率MNC为80％，CFU－GM为74％，说明程控冷冻方法是安全和可靠的。

　　目前来自1999年美国临床肿瘤学会年会报告指出大剂量化疗联合APBSCT治疗高危及转移性乳腺癌研究的大宗随机研究显示，乳腺癌强化治疗存在争议，与常规剂量对照组相比大剂量化疗治疗转移性乳腺癌患者生存期延长与无变化结果各占50％，高危性乳腺癌组仍不能定论，炎性乳腺癌组及其他亚组正在观察。我国应用该技术治疗乳腺癌及其他实体瘤的病例数因较少尚无法评价效果。国外的经验可做借鉴，且研究表明东方女性乳腺癌许多生物学特性与西方白种人不尽相同，我们仍需总结自己的经验和结论。APBSCT仍存在许多问题需要进一步探索，如：预处理方案的选择、什么时机进行移植、移植后免疫功能重建、以及干细胞采集中瘤细胞污染的检测及处理等。晚期乳腺癌治疗棘手，我们认为对特定高危性乳腺癌患者群体和部分晚期乳腺癌患者，选择适宜的预处理方案及合适时机，APBSCT在乳腺癌治疗中有重要意义，值的广泛研究和深入探索。

(柏敏霜校对)

　　本文课题受天津市科委攻关计划项目资助(983113511)

　　宁连胜（天津医科大学附属肿瘤医院乳腺科 天津市300060))

　　方志沂（天津医科大学附属肿瘤医院乳腺科 天津市300060)

　　李云英（天津医科大学附属肿瘤医院化疗科 天津市300060)

　　张谨（天津医科大学附属肿瘤医院乳腺科 天津市300060)

　　李丽庆（天津医科大学附属肿瘤医院化疗科 天津市300060）

　　参考文献

　　1，Skipper HE, Schable FM, Wilcox WS. Experimental evaluation of potential anticancer agents.XⅢ . On the criteria and kinetic associated with “curability” of experimental leukemia. Cancer Chemother Rep, 1964;35:1～ 111

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　　11，Peter WP, Rosner G, Ross M, et al:Comparative effects of granulocyte－ macrophage colony－ stimuylating factor(GM－ CSF) and granulocyte colony－ stimulating factor(G－ CSF)on priming peripheral blood progenitor cells for use with autologous bone marrow after high－ dose chemotherapy Blood, 1993, 81:1709

1999－09－14收稿

　　1999－12－22修回