乳腺癌端粒酶活性的研究

中华肿瘤杂志 1999年第4期第21卷 临床研究

作者：杨文涛　许良中　张泰明　朱伟萍　李小妹　金爱萍　何开玲

单位：200032 上海医科大学肿瘤医院分子病理研究室

　　关键词： 乳腺肿瘤/酶学；乳腺肿瘤/病理学；端粒酶/分析；端粒重复序列扩增法

　　【摘要】　目的　探讨乳腺癌中端粒酶活性的意义及其与腋窝淋巴结状态的关系。方法　用建立在多聚酶链反应(PCR)基础上的端粒重复序列扩增法(TRAP)，对88例乳腺癌和16例乳腺良性疾病进行端粒酶活性检测。结果　88例乳腺癌中，75例(85.2%)检测到端粒酶活性(其中3例导管内癌端粒酶均为阳性)，而在16例乳腺良性疾病中仅2例(12.5%)端粒酶阳性，两组的差异有显著性(P＜0.001)。此外，端粒酶活性在淋巴结阳性的乳腺癌(93.2%)中显著高于淋巴结阴性者(77.3%，P＜0.05)。结论　端粒酶活化在乳腺癌的发生过程中起重要作用，且有可能成为乳腺癌发生的早期指标。

Telomerase activity in breast carcinoma

　YANG Wentao, XU Liangzhong, ZHANG Taiming, et al. Laboratory of Molecular Pathology, Cancer Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032

　　【Abstract】　Objective　To investigate the significance of telomerase activity in breast carcinoma with respect to axillary lymph node status.Methods　Telomerase activity was analyzed in 88 breast carcinomas specimens and 16 benign breast lesions, using PCR-based telomeric repeat amplification protocol (TRAP) assay.Results　Telomerase activity was detected in 75 (85.2%) of 88 breast carcinomas (including three breast carcinomas in situ which were all positive for telomerase activity), whereas in benign breast lesions analyzed only 2 (12.5%) of 16 cases were positive (P＜0.001). Besides, telomerase activity was significantly higher in node-positive breast carcinomas (93.2%) than in node-negative ones (77.3%, P＜0.05).Conclusion　The results suggest that telomerase activation plays an important role during breast carcinoma progression. It may serve as an early marker of breast carcinoma.

　　【Subject words】　Breast neoplasms/enzymology　　Breast neoplasms/pathology　　Telomerase/analysis Telomeric repeat amplification protocol

　　端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，具有维持染色体的稳定性和DNA完整复制的功能^［1］。端粒酶是一种核糖核蛋白，由小分子RNA和蛋白质构成，其RNA组份包含和端粒重复序列互补的顺序^［2］。最近的研究显示，端粒酶活化可使细胞发展成为永生化细胞或无限增殖的癌细胞，是恶性肿瘤发生发展的重要一步。为了探索乳腺癌中的端粒酶活性及其与腋窝淋巴结状态的关系，我们采用建立在多聚酶链反应(PCR)基础上的端粒重复序列扩增方法(TRAP)，对良性乳腺组织、乳腺原位癌和浸润性乳腺癌中的端粒酶活性进行了研究。

材料与方法

　　1.组织标本：88例乳腺癌和16例良性乳腺病变标本均取自我院1997～1998年的外科手术患者。所有标本均在术后30分钟内采集并速冻于液氮中。所有病例均经病理证实，组织学诊断见表1。

表1　104例乳腺组织中端粒酶活性检测结果

　　2.端粒酶提取：将组织标本从液氮中取出，切10 μm厚冰冻切片10张放入Eppendorf管，加400 μl冰冷的CHAPS｛3-［(3-胆酰胺丙基)-二乙铵］-丙磺酸｝(pierce)裂解液，混匀后放至冰浴30分钟，以14 000×g 4℃离心30分钟，吸取上清液，速冻于-70℃冰箱。使用前，用考马斯亮兰法对提取物进行蛋白定量，将蛋白浓度调节至5 μg/μl。此外，通过冰冻切片的HE染色，可对每个标本的组织学诊断进一步核实。

　　3.端粒重复序列的扩增：用Oncor公司的TRAP-eze试剂盒进行端粒酶活性测定，方法略有改进。25 μl总反应体积中包括1 μl抽提产物、TS和TRAP混合引物，20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，1.5 mmol/L MgCl₂，63 mmol/L KCl，0.5%Tween-20，1 mmol/L EGTA，50 μmol/L dNTP和2.5个U的Taq DNA多聚酶。TS引物在端粒酶介导下30℃延伸30分钟，混匀后在热循环仪(PE公司)上进行35个循环的PCR反应，循环条件为：94℃ 45秒、55℃ 45秒和72℃ 1分钟。

　　4.TRAP产物分析：25 μl PCR产物经12.5%非变性聚丙烯酰胺电泳，银染后用IS 1 000凝胶摄录系统(美国Alpha innotech公司)进行观察和照相。为了确定分析的特异性，设立加热灭活对照，即将同一份端粒酶抽提产物分为经85℃加热灭活处理和未经处理两组，然后同时进行TRAP分析，真正的阳性标本表现为未经处理时有阳性条带，而85℃加热灭活处理后阳性条带消失。为了排除某些组织标本中可能存在Taq酶抑制物从而影响TRAP反应造成假阴性，特设立内对照(36 bp的标准DNA)与端粒酶延伸产物共同扩增。内对照片段相当短，因而不会在视觉上干扰对端粒酶梯状条带的观察。对端粒酶阴性的标本重复进行TRAP分析，使反应液中蛋白质含量分别为0.05 μg和0.5 μg。

　　5.统计学分析：采用χ²检验，P＜0.05为统计学上有显著意义。

结果

　　在88例乳腺癌中，75例(85.2%)检测到端粒酶活性，阳性标本表现为间隔6个核苷酸的阶梯状TRAP产物，若预先热处理，则不出现该TRAP产物。在对照组中，4例癌旁组织、1例乳腺腺病、4例乳腺小叶增生和1例乳腺管内乳头状瘤均为端粒酶阴性，而6例纤维腺瘤中2例显示端粒酶活性。乳腺癌和乳腺良性病变间的差异有显著性(P＜0.001)。各种组织学类型乳腺癌的端粒酶活性见表1。

　　在44例腋窝淋巴结有转移的乳腺癌中，41例(93.2%)显示端粒酶活性。在44例腋窝淋巴结阴性的乳腺癌中，34例(77.3%)有端粒酶活性。两者间的差异有显著性(P＜0.05)。

讨论

　　端粒与端粒酶是近年来受到国际医学生物学界高度重视的研究热点之一。人类端粒由6碱基重复顺序TTAGGG和结合蛋白组成，随着细胞的不断分裂，端粒逐渐缩短，从而可导致染色体不稳定，细胞衰老和死亡。端粒酶可在细胞染色质末端不断合成端粒DNA序列，维持端粒长度，阻止其丢失。与良性病变相比，大多数人类恶性肿瘤中的端粒酶活性显著升高^［3］。国外已有几个研究小组对乳腺癌中的端粒酶活性进行了报道。但到目前为止，中国对乳腺癌的端粒酶活性还尚无报道。我们对良性乳腺病变和乳腺癌中的端粒酶活性进行了检测，在88例乳腺癌中，75例(85.2%)表现有端粒酶活性，而在16例乳腺良性病变中，仅2例(12.5%)显示端粒酶活性(P＜0.001)。需强调的是，我们对每例标本都进行了连续冰冻切片，从而可进一步证实组织学诊断。这使我们放弃了3例所谓的“癌旁乳腺组织”，因为事实上其中包含了癌细胞。我们的结果提示，端粒酶激活在乳腺癌的发生过程中起重要作用。

　　令人感兴趣的是6例纤维腺瘤中有2例(33.3%)具有端粒酶活性，这与其他良性乳腺病变不同。纤维腺瘤是一种双向性的乳腺良性肿瘤，有上皮和间质两种成分的增生。尽管它们往往有包膜且不转移，但有时能生长到较大的体积。Hiyama等^［4］在20例纤维腺瘤中发现9例(45.0%)端粒酶阳性，他认为表达端粒酶的纤维腺瘤患者今后发展为乳腺癌的危险性较大，但这需要长期随访来证实。Sugino等^［5］报道15例纤维腺瘤中有1例端粒酶阳性，这1例为幼年性纤维腺瘤，此种肿瘤生长速度较快，可能在病变过程中干细胞被激活，重新分化成腺腔上皮或肌上皮，从而导致端粒酶阳性。我们同意Nawaz等^［6］的观点，即在纤维腺瘤形成过程中可能有端粒酶短暂激活。这种端粒酶的激活可能受雌激素调节，且是可逆性的。纤维腺瘤在其生长阶段可能表达端粒酶，而当肿瘤达到一定大小或发生退行性变和玻璃样变时可停止表达端粒酶，当然要解释这一问题还需更深入的研究。

　　导管内癌一直被认为是乳腺癌发生、发展的早期阶段，因此，对导管内癌的端粒酶活性研究显得极为重要。到目前为止，有关导管内癌的端粒酶活性报道还较少。Sugino报道了2例导管内癌均未检测到端粒酶活性^［5］。相反，Bednarek在3例导管内癌中均发现端粒酶活性^［7］，与我们的结果一致。Tsao等^［8］报道12例导管内癌中75.0%含有端粒酶活性，这些结果提示，至少部分导管内癌含有端粒酶活性，因此端粒酶可能在乳腺癌发生的早期即被激活。

　　Hiyama等^［4］发现端粒酶活性与一些已知的预后因素有关，如肿瘤大小、淋巴结状态和临床分期。淋巴结转移组中端粒酶阳性者占96.6%，而无淋巴结转移组中端粒酶阳性者占81.1%，两组差异有显著性(P=0.01)。我们的结果支持Hiyama等的观点，本研究淋巴结阳性的乳腺癌中端粒酶活性(93.2%)显著高于淋巴结阴性者(77.3%)。这些结果均提示端粒酶活性可能成为肿瘤浸润性的一个预测性标记物，可将具有淋巴结播散潜能的原发性乳腺癌与那些生长较为局限者鉴别开。若大量研究均证实端粒酶可成为这样一个指标，那对患者的预后将是极为有意义的。然而，另一些研究结果并未证实此点，而发现端粒酶水平与淋巴结状态和其他已知的预后因素无关。不同实验室结果间的差异可能与其实验操作上的差别有关。例如：从组织中提取端粒酶的方法(有的通过冰冻切片，有的采用组织粉碎)、电泳时TRAP产物的上样量(有的8 μl，有的25 μl)、放射自显影的曝光时间等。

　　总之，我们的结果显示，在绝大部分乳腺癌(包括导管内癌)中均能检测到端粒酶活性，其中淋巴结阳性的乳腺癌较淋巴结阴性者更容易检测到。相对而言，乳腺良性病变中表达端粒酶者很少。这些结果提示端粒酶的激活在乳腺癌的发生过程中起重要作用。尽管在一些非恶性病变如纤维腺瘤中端粒酶活性的意义目前还不甚清楚，但端粒酶仍有可能成为乳腺癌的早期诊断指标。

　　参考文献

　　1　Rhyu MS. Telomeres, telomerase, and immortality. J Natl Cancer Inst, 1995,87：884-894.

　　2　Muller HJ. The remaking of chromosomes. Collecting Net, 1938,13：181-185.

　　3　Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994,266：2011-2015.

　　4　Hiyama E, Gollahon L, Kataoka T, et al. Telomerase activity in human breast tumors. J Natl Cancer Inst, 1996,88：116-122.

　　5　Sugino T, Yoshida K, Bolodeoku, et al. Telomerase activity in human breast cancer and benign breast lesions: diagnostic applications in clinical specimens, including fine needle aspirates. Int J Cancer, 1996,69：301-306.

　　6　Nawaz S, Hashizumi TL, Markham NE, et al. Telomerase expression in human breast cancer with and without lymph node metastases. Am J Clin Pathol, 1997,107：542-547.

　　7　Bednarek A, Sahin A, Aldaz CM. Telomerase in human breast cancer. Proc Am Assoc Cancer Res, 1996,37:562.

　　8　Tsao JL, Zhao Y, Lukas J, et al. Telomerase activity in normal and neoplastic breast. Clinical Cancer Res, 1997,3：627-631.

(收稿：1998-09-14　　修回：1998-12-09)