乳腺癌组织中端粒酶活性的研究

肿瘤防治杂志 2000年第6期第17卷 基础研究

作者：潘立峰　王立华　周宝臣

单位：潘立峰　王立华　周宝臣（唐山市063000　华北煤炭医学院附属开滦医院普外科）

关键词：乳腺肿瘤；端粒酶；端粒重复序列扩增

　　【摘要】　目的：研究乳腺癌组织、癌旁组织、良性乳腺病变、正常乳腺组织中的端粒酶活性，探讨其作为乳腺癌肿瘤标志物的可能性。方法：采用端粒重复序列扩增法(telomeraic repeat amplification protocol,TRAP)来检测 36 例乳腺癌及其相应癌旁组织，12 例良性乳腺病变，6 例正常乳腺组织中的端粒酶活性。结果：36 例乳腺癌组织中，有 33 例端粒酶表达阳性，其阳性率为91.7%，而且与肿瘤的大小，淋巴结的状态，临床分期有相关性。36 例癌旁组织中，有 2 例端粒酶表达阳性，阳性率为5.6%。12 例良性乳腺病变中，仅有 1 例端粒酶表达阳性，阳性率为8.3%。6 例正常乳腺组织端粒酶表达均为阴性。结论：乳腺癌组织中普遍存在端粒酶活性表达，端粒酶有可能成为诊断乳腺癌的肿瘤标志物。

　　中图分类号：R737.9　　　　文献标识码：A　　　　文章编号：1009-4571(2000)06-0588-03

Study of Telomerase Activity in Breast Cancer

PAN Li-feng,WANG Li-hua,ZHOU Bao-chen．

　　(Department of Genernal Surgery of Affiliated Kailuan Hospital of North China Coal Medical College. Tangshan　063000)

　　【Abstract】　Objective:To investigate the telomerase activity in human breast cancer and tumor-adjacent tissue and to investigate the possibility of telomerase as tumor biological marker.Methods:Telomerase activity in 36 breast cancer and tumor-adjacent tissues,12 benign lesions and 6 normal breast tissues,was examined by telomeric repeat amplification protocol(TRAP) assay.Results:33 of 36 breast cancer tissues and 2 of 36 adjacent tiusses specimens were positive for telomerase activity with a positive rate of 91.7% and 5.6%,respectively .There was correlation between the tumor size and their telomerase activity,so did lymphatic metastasis and clinicopathologic stage.In benign lesions, only 1 of 12 cases was positive with a positive rate of 8.3% Telomerase activity was negative in 6 breast tissues.Conlusions:Positive telomerase activity occurs in the majority of breast cancer.It can be used as a tumor marker in the diagnosis of breast cancer.

　　【Key words】　breast neoplasms;telomerase;telomeric repeat amplification protocol;

　　目前研究表明，端粒酶与肿瘤密切相关，它有助于肿瘤的无限性生长。因此，端粒酶能否作为肿瘤的特异性标记物已成为新的研究热点。正常情况下，大部分体细胞及良性组织中的端粒酶活性检出率仅4%左右，但在恶性肿瘤组织中端粒酶的检出率高达84%～95%^［1，2］。乳腺癌端粒酶活性的研究国外已有报道^［3～6］。我们采用以 PCR 技术为基础的TRAP(telomeric repeat amplification protocol)方法，对乳腺癌及其相应癌旁组织，乳腺良性肿瘤及正常乳腺组织进行端粒酶活性检测，以探讨端粒酶与乳腺癌发生发展的关系。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本来源

　　36 例乳腺癌组织及其相应癌旁组织(距肿瘤2 cm)，12 例良性乳腺病变和 6 例正常乳腺组织均取自于我院1998～1999年手术切除标本，标本均于离体后半小时内采集，液氮速冻，后转至-80℃冰箱贮存备用。所有病例均经病理证实。

　　1.2　端粒酶提取

　　每例标本取100 mg组织，用50 ml液氮在研钵中研成粉末后转至1.5 ml试管中，立即加入 400 μl冷洗液(10 mmol/L hepes-KOH pH7.5，1.5 mmol/L Mgcl₂，10 mmol/L Kcl,1 mmol/L DTT),混匀后，0℃放置 5 min，2 000 r/min 4℃离心5 min，弃上清，加入预冷的裂解液 200 μl(10 mmol/L Trio-Hcl pH7.5，1mmol/L Mgcl₂，1mmol/L EGTA,5 mmol/L二巯基乙醇，0.5% CHAPS，10% 甘油)，混匀后，0℃ 裂解 30 min，13 500 r/min 4℃离心 30 min，吸取上清至一新预冷管中，采用 BCA 试剂盒(Sigma 公司产品)进行蛋白质含量测定，放-80℃冰箱冻存。

　　1.3　端粒酶检测

　　采用 TRAP 法检测端粒酶活性^［2］，反应体积 25 μl，反应体系含 20 mmol/L, Tris-Hcl(pH 8.3),1 mmol/L Mgcl₂，63 mmol/L KCL,0.005%Tween-20,1mmol/L EGTA,50 mmol/LdNTP,1 μgT₄ 基因 32 蛋白，0.1 μg/ml BSA,74 k Bq χ³²P-dCTP,2 μTaq酶和0.1 μg TS引物(5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’)。加端粒酶提取物 6 μg，混匀后于 30℃保温 30 min，90℃90 min灭活端粒酶，加0.1 μg CX引物(5’-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTTA-3’)，混匀后在 PE480PCR仪上进行 31 个循环，循环参数为90℃40 min，50℃40 min，72℃50 min，最后于72℃延长10 min，加入6 μl电泳加样缓冲液，在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离后，凝胶与X线胶片置-8℃放射自显影，12 h后显示结果。当出现6 bp的梯形带时结果为阳性，以6 μg肺癌细胞系GLC 蛋白作为阳性对照，阴性对照在反应液中不加组织提取物。

　　1.4　统计分析

　　应用 SPSS 软件χ²检验进行统计学处理。

　　2　结果

　　2.1　乳腺组织中端粒酶活性表达

　　在 36 例乳腺癌组织中，有 33 例端粒酶表达阳性，阳性率为 91.7%；在 36 例癌旁组织中，有 2 例端粒酶表达阳性，阳性率为 5.6%。12 例乳腺良性病变中，有 1 例端粒酶表达阳性，其余 6 例乳腺小叶增生，3 例乳腺腺病，2 例管内乳头状瘤均为阴性。6 例正常乳腺组织均为阴性。乳腺癌与乳腺良性病变，正常乳腺组织之间端粒酶活性差异有显著性(P＜0.001)。

表1　端粒酶活性在不同临床分组资料中的表达

　　2.2　端粒酶活性与乳腺癌大小、临床分期、淋巴结转移的关系

　　Ⅰ期乳腺癌与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌相比，端粒酶活性显著为低(P＜0.05)；肿瘤直径大于 2 cm 组及有淋巴结转移组端粒酶活性明显高于肿瘤直径小于 2 cm组及无淋巴结转移组(P＜0.05)。见表1。

　　3　讨论

　　端粒酶是一种糖核蛋白酶，由 RNA 和蛋白质组成，具有逆转录酶的功能，能以自身的 RNA 为模板合成端粒 DNA，从而维持端粒的长度。人类端粒是由10～15 KB的重复序列(TTAGGG)组成，随着细胞分裂而进行性缩短，当达到一定程度时，细胞就衰老死亡。端粒酶可使端粒长度保持相对稳定，阻止其丢失。与良性病变相比，大多数人类恶性肿瘤中的端粒酶活性显著升高^［2］。Hiyama等^［3］研究发现，在 140 例乳腺癌组织中有 130 例为端粒酶阳性，阳性率为 93%；而 55 例相应癌旁组织中只有 2 例呈端粒酶阳性。研究表明^［4，5］在良性乳腺病变和正常乳腺组织中端粒酶则多为阴性，可见端粒酶与乳腺癌的发生发展密切相关。本研究对良性乳腺病变、乳腺癌及癌旁组织中的端粒酶活性进行了检测。在 36 例乳腺癌中，33 例(91.7%)为端粒酶阳性；而相应癌旁组织中有 2 例(5.6%)端粒酶阳性；12 例良性乳腺病变中，仅 1 例(8.3%)显示了端粒酶活性；6 例正常乳腺组织均为阴性。提示端粒酶在乳腺癌发生发展中起着重要作用，有希望成为乳腺癌诊治的理想标志。

　　端粒酶的活化可能与肿瘤的某些生物学行为有关。Hiyama等^［3］研究发现，在乳腺癌中端粒酶阳性者病灶较阴性者大，其淋巴转移率高，且晚期肿瘤端粒酶阳性率明显高于早期肿瘤。杨文涛等^［5］也发现淋巴结阳性的乳腺癌端粒酶活性(93.2%)高于淋巴结阴性者(77.3%)。我们的结果支持上述观点。这些结果均提示端粒酶表达的高低可能与肿瘤细胞侵袭，肿瘤进展和转移潜能有关系。另外，Hiyama等^［3］曾报道端粒酶活化可能对乳腺癌预后估计有重要意义。Andrzej等^［6］通过对乳腺癌的定量研究发现，端粒酶表达水平的高低与预后指标无明显联系。因此，有关端粒酶表达与预后的关系须进一步研究。

　　既然端粒酶普遍存在于恶性肿瘤细胞内，又是肿瘤细胞“永生”所必需的。因此，将端粒酶作为特异性肿瘤细胞标志物及针对端粒酶的基因治疗可能有重要意义。相信随着对端粒酶研究的深入，将有助于阐明端粒酶的作用调控机制，为肿瘤的诊治提供新的理论基础。

参考文献：

　　［1］　郑小飞，孙志贤，主编.端粒酶活性检测及其在恶性肿瘤诊断中的应用［M］.北京：军事医学科学出版社，1997.49-56.

　　［2］　Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immoratal cells and cancer［J］.Science,1994,266:2011-2015.

　　［3］　Hiyama E,Gollahon L,Kataoka T,et al.Telomerase activity in human breast tumors［J］.J Natl Cancer Inst,1996,88:116-122.

　　［4］　Sahy JW,Bacchetti S,A Survey of telomerase activity in human cancer［J］.Eur J Cancer,1997,33:787-791.

　　［5］　杨文涛，许良中，张泰明，等.乳腺癌端粒酶活性的研究［J］.中华肿瘤杂志，1999，4：278-280.

　　［6］　Andrzej K,Bednarek,Aysegul S,et al.Analysis of telomerase activity levels in breast cancer:positive detection at the in situ breast carciroma stage［J］.Clinical Cancer Res,1997,3:11-16.

收稿日期：2000-11-22　修回日期：2000-12-06