早幼粒细胞白血病基因的功能研究进展

中华医学遗传学杂志 2000年第2期第17卷 综述

作者：周励　陈国强　沈志祥

单位：周励（200025 上海第二医科大学附属瑞金医院 上海血液学研究所）；陈国强（200025 上海第二医科大学附属瑞金医院 上海血液学研究所）；沈志祥（200025 上海第二医科大学附属瑞金医院 上海血液学研究所）

关键词：早幼粒细胞白血病基因；维甲酸受体α；生物学功能；研究进展

　　【摘要】　为了解早幼粒白血病基因和维甲酸受体α(promyelocytic leukemia-retinoic acid receptor α，PML-RARα)的致病机理，对野生型PML基因的生物学功能的研究进展进行综述。从近年来国内外公开发表的有关报道，结合本研究所的部分研究结果，提示PML的高表达有抑制细胞生长和诱导凋亡的作用；PML可能参与基因表达的调控；且PML功能的发挥与其3个重要功能区和核内定位有关；PML与APL发病有关。表明PML具有多重生物学活性。

Progress in researches on the function of PML gene

ZHOU Li　CHEN Guoqiang　SHEN zhixiang(Shanghai Institute of Hematology, Rui Jin Hospital, Shanghai Second Medical university, Shanghai 200025 P.R.China)

　　【Abstract】　This paper was aimed to review and expound the progress in studies on biological function of wild-type PML gene and hence to have a gain in knowledge about the carcinogenesis of PML-RARα protein. Related reports issued at home and abroad and some research results from this institute were collected and reviewed. according to the data collected PML gene has many biological activites. High expression of PML gene can inhibit the growth of cells and induce apoptosis; PML gene is possibly involved in the regulation of gene expression. Moreover, the function of PML gene is related to its three important domains and its nuclear location; PML gene is associated with carcinogenesis of APL.

　　【Key words】　promyelocytic leukemia gene;　retinoic acid receptor α;　biological function；　progress in research

　　绝大多数急性早幼粒细胞性白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)存在染色体t(15;17)易位。该易位导致分别定位于染色体15q22和17q21的早幼粒细胞白血病(promyelocytic leukemia,PML)基因和维甲酸受体α(retinoic acid receptor α，RARα)基因融合，表达PML-RARα融合蛋白。体内外研究显示该蛋白既是APL发病的重要分子基础，也是全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)诱导APL细胞分化的重要靶子^［1，2］。为了解PML-RARα的致病机理，许多学者致力于野生型PML的生物学功能研究，并取得了重要进展。

　　1　PML的基本特点

　　PML属于一类新型核蛋白家族。它的N端依次包含半胱氨酸富集区、卷曲螺旋区和丝氨酸/脯氨酸富集区。其中，半胱氨酸富集区由“环指(ring finger)”结构和两个B-box结构(B1、B2盒)构成，是PML结合DNA的重要结构域，而卷曲螺旋结构域则是形成蛋白二聚体所必需的。

　　PML功能发挥与它在细胞内的定位密切相关。在非APL细胞，PML存在于核体(nuclear body,NBs)或PML致癌结构(PML oncogenic domain，POD)、ND₁₀或Kr体中。在大多数细胞，NBs的数目通常在10～30个之间。已知，NBs是一种和核基质相关的多蛋白复合体。除了PML外，它还包括SP100、NDP55、SUMO-1(也称PIC-1)、rfp(ret finger protein)、ISG-20和两个功能未明的相对分子量为65×10³和相对分子量为55×10³蛋白等。其中，SP100系原发性胆汁性肝硬化(一种自身免疫性疾病)的核抗原。SUMO-1(small ubiquitin-mediated protein,SUMO)属于泛素相关蛋白sentrin家族成员^［3］，它可能参与PML的翻译后修饰过程和介导PML的细胞内定位。新近发现，早幼粒细胞白血病锌指基因(promyelocytic leukemia zinc finger,PLZF)^［4］、低磷酸化的视网膜神经胶质瘤蛋白(nonphosphorylation of the retinoblastoma protein,pRb)^［5］、Int-6也和PML共同位于NBs中。

　　在某些疾病状态下尤其是病毒感染时，NBs可能发生改变。例如，在DNA病毒如单纯疱疹病毒和腺病毒感染过程中，NBs重新分布于纤维状结构中，而抗病毒药物干扰素则明显增加NBs的大小和数量。由于C端的不同，PML蛋白存在多种异构体。最近，Everett等^［6］发现疱疹病毒调控蛋白Vmw110引起的NBs解体与几种PML异构体丢失有关，且此过程依赖活化的蛋白体(proteasome)。进一步发现，对病毒感染最敏感的PML亚型和SUMO-1密切相关。此外，在淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)感染的细胞，PML重新分布在细胞浆，并在细胞浆内形成大核体。这可能和LCMV的Z蛋白和PML的N端区结合有关^［7］。

　　2　PML的生长抑制活性

　　PML蛋白的表达水平依细胞周期而发生改变，表现为PML在S期和G₂/M期细胞低表达，在G₁期细胞高表达。这种表达方式提示PML可能和细胞周期的调控有关。研究发现PML具有细胞生长抑制活性。例如，Mu等报告PML过度表达明显抑制HeLa细胞生长率。与亲代HeLa细胞相比，高表达PML的HeLa/PML亚克隆(HeLa/PML)的G₁期延长2倍以上。进一步发现，在HeLa/PML亚克隆中，磷酸化Rb和细胞周期蛋白-E(cyclin-E)、细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin dependent kinase,cdk)-2和p27的表达明显减少。Le等^［8］发现腺病毒-PML重组构件(Ad-PML)能有效感染乳腺癌细胞系MCF-7和SK-BR-3，并在感染后24 h出现PML蛋白的高表达。相应地，Ad-PML感染明显抑制乳腺癌细胞在体外和裸鼠体内的生长，推测这可能和PML显著下调cyclin d1、cdk-2和上调P53、P21的表达及导致Rb蛋白去磷酸化等，使细胞阻滞在G₁期有关。为了阐明PML对DNA损伤/修复的反应，Chan等^［9］发现电离辐射处理导致HeLa细胞受阻于G₁期和PML的表达有关；顺铂处理HeLa细胞也存在PML表达增加，且其表达增加发生在转录后；在转染野生型P53的HeLa细胞，PML表达增加5～10倍，提示PML表达增强明显依赖P53途径。

　　PML的生长抑制活性也在体内得到证实，如敲除PML基因的小鼠除表现为外周血、骨髓、肝、脾和淋巴结内成熟粒细胞和单核细胞显著减少外，其胚胎成纤维细胞(MEF)增殖速度和³H-TdR掺入率显著增加，S期和G₀/G₁期细胞分别明显增多和减少。此外，MEF克隆形成能力增强。在诱变剂DMBA和TPA(12-0-tetradecanoyl-phorbol-13 acetate)作用下，PML^-/-鼠皮肤乳头状瘤的发生率增加。

　　最近，Fagioli等^［10］对各种分布于细胞核和细胞浆内的PML异构体进行分析后，提出PML的生长抑制活性和其核定位有关。例如，因缺乏核定位信号(nuclear located signal，NLS)而定位于细胞浆的PML-3-4-7异构体缺乏生长抑制活性，而定位于细胞核的PML1～3异构体则重现细胞生长抑制效应。结构缺失突变研究表明，单一的PML功能区缺失并不影响其抑制生长活性。“环指”结构和B1、B2盒即赋予PML部分抑制生长活性，但当它与卷曲螺旋区融合则能完全重现野生型PML的生长抑制功能，提示PML的抑制生长活性有赖于3个重要功能区的协同作用。

　　3　PML的转录调控活性

　　PML的结构特点和它与某些已知的转录调控因子的同源性提示PML可能参与基因表达的调控。Vallian等应用GAL4/PML嵌合体和GAL4-报告基因构件对PML的转录调控活性进行了分析，发现GAL4/PML抑制GAL4反应性启动子的转录，并且其抑制作用的大小取决于细胞和启动子类型。进一步发现，PML的卷曲螺旋区和部分丝氨酸/脯氨酸富集区是其转录抑制活性所必须的。对于PML的转录抑制活性，一个典型的例子是PML有效抑制表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的转录。Vallian等^［11］发现EGFR基因启动子内存在一个由150 bp构成的特定序列(该序列在-150～-16bp，与ATG转录起始点有关)。瞬间转染实验显示该序列的转录受Sp1的调控，而PML蛋白能以剂量依赖的方式抑制这种Sp1依赖的启动子活化。其机理可能是：PML通过其卷曲螺旋区和Sp1的C末端区(DNA结合区)结合，从而特异地破坏Sp1和DNA的结合。因此，PML与Sp1的相互作用可能代表一种对EGFR和其他Sp1靶启动子转录负调节的新机理。此外，PML可能抑制neu癌基因的表达并阻断激活neu的相关信号来抑制NIH/3T3细胞转化。IFN诱导的PML高表达也能通过干扰疱疹性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)mRNA和蛋白质的合成，抑制病毒的增殖。其效应大小取决于PML的表达水平和病毒感染量^［12］。

　　PML作为转录调控因子，在某些情况下也呈现转录活化作用。例如，PML促进类固醇激素受体转录活化并改变它们的亚细胞分布，推测这可能通过和其他转录调节因子互相作用来实现的。最近，Vallian等^［13］发现PML的转录调节活性与AP-1复合体有关。AP-1是细胞核内转录因子，主要由Fos、Jun、ATF蛋白家族组成。PML并不直接与AP-1的作用位点发生作用，而是通过作用于AP-1的组成成分或调控生长的相关因子激活AP-1。实验显示，PML的二聚体形成区与Fos蛋白家族具有明显同源序列。Fos完整的C-末端区和PML的环指、B1盒及核内定位区对于PML和Fos的协同效应非常重要。PML与Fos协同作用促进AP-1转录活性可能与PML生长抑制作用有关。

　　4　PML的凋亡诱导活性

　　Borden等^［14］发现感染单链RNA病毒的细胞导致PML重新分布于胞浆中，并导致细胞抵抗血清剔除诱导的凋亡效应。反义PML寡核苷酸促进血清剔除后细胞的存活，提示PML直接参与细胞凋亡过程。转染实验进一步地显示，PML的促凋亡活性与其称作“环指”结构的锌结合区有关。Fagioli等^［10］提出PML的生长抑制活性的细胞学基础就是诱导细胞凋亡，但Mu等发现PML高表达并不诱导Hela细胞凋亡。最近，人们开始了解PML诱导细胞凋亡的分子机理。Quignon等^［15］认为PML诱导的细胞凋亡信号途径不依赖重要的凋亡蛋白酶caspases的活化，因为PML诱导的细胞凋亡在缺乏caspase-3活化的情况下发生。Caspase抑制物如zVAD则能加速PML诱导的细胞凋亡。作者也发现caspase-1或caspase-3活化诱导的细胞核凋亡需要PML及一些内源性细胞死亡刺激物的参与。Wang等^［16］也提出PML是多种凋亡诱导剂如死亡受体Fas和caspase、IFNs(inferons),TNF(tumor necrosis factor),ceramide及DNA损伤诱导的凋亡所必需的。Carlile等^［17］发现在RNA的参与下，GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和PML共同定位于NBs。作者根据NBs的破坏导致细胞凋亡减少和GAPDH诱导神经原细胞凋亡的事实，提出PML-GAPDH相互作用参与细胞凋亡的调控。此外，有资料显示PML表达的缺乏与肿瘤的发生和侵犯有关，这与肿瘤细胞凋亡失控是一致的。Le等^［8］也提出PML高表达对乳腺癌细胞生长的抑制和它诱导细胞凋亡有关。

　　5　PML-RARα和APL

　　转基因小鼠研究显示由特异性染色体t(15;17)易位产生的PML-RARα蛋白是APL的重要发病基础。相应地，降解该融合蛋白可能是某些因素诱导APL细胞分化和(或)凋亡的重要机理。例如，于文强等^［18］报道针对PML-RARα融合基因的反义寡核苷酸(AS)能够抑制APL细胞系的生长，并诱导其分化。陈烨等^{［19，20］}报道除了促分化效应外，抗PML-RARα的AS也能诱导NB4细胞凋亡。最近，在我国率先开展的三氧化二砷(As₂O₃)治疗APL的研究引起国际血液肿瘤界的广泛兴趣。我们和其他一些作者的研究显示As₂O₃对PML-RARα蛋白的调变和降解可能与其诱导凋亡和部分分化效应有关^［21］。但是，对于PML-RARα蛋白引起APL的分子机理尚不完全清楚。目前大多数认为PML-RARα蛋白通过破坏NBs，从而改变PML的正常核内定位，使其丧失抑制细胞生长和诱导细胞凋亡的功能。但是，一些事实并不完全支持这种假设。例如，有报道显示PML-RARα剪切并不足以克服NB4细胞的分化受阻^［22］。Fanelli等^［23］认为PML-RARα的降解介导维甲酸抗性APL克隆NB4.00116D对ATRA的耐药性。PML-RARα的转染表达恢复该克隆对RA的敏感性。另一方面，有人认为PML-RARα与PML生物学活性存在协同作用，如PML-RARα诱导大多数非造血细胞系凋亡，但促进造血细胞系的生存。对后者的解释可能是融合蛋白的PML部分与RARα融合及与组织特异因子互相作用后获得了促进生长的活性。总之，PML-RARα的活性机理是极其复杂的。一方面，PML-RARα蛋白保留了PML分子的“环指”结构，B1、B2盒和卷曲螺旋结构域。因此，它也可能保留PML的抑制生长和诱导凋亡活性。另一方面，NBs也可能不是PML蛋白作用的唯一活性位点。

　　基金项目：国家杰出青年科学基金(397250111)；国家自然科学基金(39770410)

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收稿日期：1999-04-25