福建沿海地区人T淋巴细胞白血病病毒1型膜基因的克隆和系统树分析

病毒学报 2000年第3期第16卷 论　著—人与动物病毒

作者：张国忠　王颖彬　张军　逄淑强　徐颖潇　杨丰　夏宁邵

单位：张国忠（福建省莆田市中心血站，福建 莆田 351100）；王颖彬　张军　逄淑强　徐颖潇　杨丰　夏宁邵（细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室，厦门大学，福建 厦门 361005）

关键词：人类T淋巴细胞白血病病毒；亚型；全球传播

　　摘要：人T淋巴细胞白血病病毒1型（HTLV-1）是最早发现的一种RNA肿瘤病毒。利用HTLV-1基因组长末端重复区（LTR）或膜基因（env）序列进行系统树分析，可分为C、J、WA、CA和M 5个亚型。为了解我国HTLV-1流行区毒株的主要基因型别，从福建莆田地区克隆出3株HTLV-1的env基因。其序列与已知各亚型代表株进行系统树分析，结果表明均为C亚型。首次证实了中国大陆HTLV-1　C亚型的存在。该地区地处福建沿海，近几个世纪以来对海外人口迁徙频繁。这一地区HTLV-1　C亚型的存在是否与目前全球性C亚型的分布有关，值得进一步研究。

　　中图分类号：R373；Q78 　　文献标识码：A

　　文章编号：1000－8721（2000）03-0193-05

The Cloning and Phylogenetic Analysis of Envelope Gene of HTLV-1 Virus from the Coastal Region of Fujian

WANG Ying-bing，ZHANG Jun，PANG Shu-qian，

　　XU Ying-xiao，YANG Feng，XIA Ning-shao

　　（The Key Laboratory of Ministry of Education for Cell Biology and Tumor Cell Engineering, Xiamen University, Xiamen 361005, China）

　　ZHANG Guo-zhong

　　（ The Central Blood Bank of Putian, Fujian, Putian 351100, China）

　　Abstract: The human T-cell leukemia/lymphotropic virus type 1(HTLV-1)belongs to the Oncovirinae subfamily of retroviruses. Phylogenetic analysis of the long terminal repeat(LTR)and env gene of HTLV-1 gave a phylogenetic classification of HTLV-1 genotypes into five major molecular subtypes: Cosmopolitan(C), Japanese(J), West African(WA), Central African(CA), and Melanesian(M). In order to understand the major genotype of HTLV-1 prevalent in China, HTLV-1 env gene was amplified by PCR and sequenced from peripheral blood lymphocyts of three HTLV-1 carriers in the Putian region of Fujian Province. Phylogenetic analysis was done with env sequences of three isolates and the representative strains of five major HTLV-1 subtypes. The results showed that all the three isolated HIV-1 strains were grouped into subtype C. Thus, the existence of HTLV-1 subtype C virus in China mainland was firstly confirmed. Since Putian region is located along the coast of Fujian, where oversea emigration have been frequent in recent several centuries, whether it associated with the global dissemination of HTLV-1 subtype C deserves further study.

　　Key words: human T-cell leukemia/lymphotropic virus; subtype; global dissemination

　　人T淋巴细胞白血病病毒（human T－cell leukemia／lymphotropic virus, HTLV）是最早发现的一种人逆转录病毒，属于逆转录病毒科肿瘤病毒亚科哺乳类C型病毒。根据基因组及血清学反应可将其分为人T淋巴细胞白血病病毒1型（HTLV-1）和2型（HTLV-2），两型病毒基因组同源性大于60％。HTLV-1主要侵染T淋巴细胞，可引起成人T细胞白血病（ATL）、热带下肢痉挛性瘫痪或HTLV-1相关脊髓病（TSP／HAM），并且在多种自身免疫病患者体内也发现了该病毒的存在。 目前已报道的世界各地的HTLV-1毒株基因组间的差异均极小，核苷酸同源性基本上都在90％以上，而且众多研究已清楚地表明HTLV-1的变异主要取决于其地理分布，而基本与其致病性无关。Vidal等^［1］根据HTLV-1基因组的长末端重复区（LTR）和膜基因（env）序列进行系统发生树分析，将来自日本、中东、美洲（包括加勒比地区）、非洲等地区的HTLV-1大致分为COSMOPOLITAN（C亚型）、JAPANESE（J亚型）、WEST AFRICAN（WA亚型）、CENTRAL AFRICAN（CA亚型）和MELANESIAN（M亚型）等5个亚型。

　　目前我国已发现几个HTLV-1流行区，而且不断有一些地区报告了HTLV的散发^［2－8］。初步明确流行于我国的HTLV毒株的基因类型，对于研制我国的HTLV诊断试剂和疫苗，制定相应防治策略，以及对深入阐明这一病毒的全球传播途径及起源等，都将有十分重要的意义。

　　材料与方法

　　1　样品的采集及处理　3例HTLV-1抗体阳性者（分别编号为S13、S14、S15）来自福建省莆田市的3个乡本地长住居民，无出国史，无受血史，未有任何已知的HTLV相关疾病症状，彼此无亲缘关系。S13为男性，S14、S15为女性。每例采集静脉血5ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞。

　　2　核酸提取　以TaKaRa公司的Dr.GenTLE^TM基因组DNA抽提试剂盒提取核酸，严格按试剂盒操作手册进行，所得DNA溶于500μl去离子水中，－20℃冷冻保存。

　　3　PCR扩增　参照HTLV-1型HL1PROP株序列（GenBank Accession Number：M33896）设计引物（表1），扩增HTLV-1 env基因的gp46片段。以F1／R1为外侧扩增引物，进行第一次PCR反应,反应条件为94℃预变性10min；94℃　50s，52℃　50s，72℃　90s，25个循环；72℃后延伸10min。取0.5μl第一次PCR产物，用F2／R2作为内侧引物进行第二次PCR反应，反应条件：94℃预变性5min；94℃　50s，55℃　50s，72℃　90s，25个循环；72℃后延伸10min。

　　4　PCR产物纯化、克隆及测序　第二次PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，对照标志物无误后，切下特异扩增带，用胶回收试剂盒（上海华舜公司）回收纯化扩增产物，克隆入pMD18-T载体（TaKaRa公司），转化大肠杆菌DH5α株。由上海博亚生物公司进行双向序列测定。

表1　PCR引物

Table 1　Primers used for PCR

　　5　DNA序列同源性比较及系统树分析　以DNASIS软件（Hitachi Software Engineering Co.1992）进行同源性比较。以CLUSTAL X软件用Neighbour Joining方法进行系统发生树分析，以TreeView软件（1.5.2版）绘制发生树图。结　　果

　　1　HTLV-1 env gp46基因的克隆

　　从福建沿海HTLV流行区3例HTLV感染者淋巴细胞中提取染色体DNA，以巢式及半巢式PCR扩增HTLV的gp46基因，如果如图1所示。2、3、4这3条泳道在966bp处有一条清晰的带，与预期结果相同。回收PCR产物，克隆入T载体，测序后证实包含HTLV－1型env区gp46的全编码区。

图1　PCR扩增的env基因片段

　　Figure 1　The env gene fragment amplified by PCR

　　Lane 1. DNA marker DL 2,000(TakaRa); Lane 2-4. env gp46 gene fragment; Lane 2. Sample S13; Lane 3. Sample S14; Lane 4. Sample S15.2　同源性分析

　　S13、S14及S15的核苷酸和氨基酸序列均高度同源，而且与5个基因亚型代表株间的核苷酸及氨基酸同源性也均在90％以上，而其中又以与C亚型、J亚型的同源性最高（表2）。各毒株间gp46蛋白的氨基酸变异较核苷酸为小，而且均匀分布于整个序列中（图2）。

表2　福建HTLV-1株与HTLV-1各亚型代表株env gp46片段序列的同源性比较

　　Table 2　Homology comparison of env gp46 sequence of Fujian HTLV-1 with that of HTLV-1 subtype representative strains

　　*: GenBank Accession Number: S13, AF226596; S14, AF226594; S15, AF226595; C, AF003009; J, M33896; WA, D13784; CA, L26586; M, L02534. &: The upper row is nucleiotide homology, and the lower row is amino acid homology.3　系统树分析

　　用S13、S14、S15和5个亚型的代表株的完整gp46基因序列进行系统发生树分析，结果显示S13、S14和S15均属于C亚型（图3）。

图2　福建HTLV-1株与HTLV-1各亚型代表株env gp46氨基酸序列的同源性比较

　　Figure 2　 Homology comparison of env gp46 amino acid sequence of Fujian HTLV-1 with that of HTLV-1 subtype representative strains

图3　福建地区HTLV-1毒株序列与5种亚型代表株的系统树分析

　　Figure 3　Phylogenetic analysis of Fujian HTLV-1 sequences (S13,S14,S15) with five subtype representative strain sequences

　　GenBank Accession Number: S13, AF226596; S14, AF226594; S15, AF226595; Subtype C: C1, AF003009; C2, L76064; Subtype J: J1, M33896; J2, M37301; Subtype WA: WA, D13784; Subtype Ca: CA, L26586; Subtype M: M, L02534.

　　讨　　论

　　迄今世界各地报道的HTLV-1毒株间的基因组变异极小，核苷酸同源性均在90％以上，这是HTLV与其它各种已知病毒相比的一个显著特征。这一特征使之基本上可以通过特定感染人群的迁移历程而追踪其全球传播途径及起源^［9］。Vidal等^［1］、Gesain等^［10］根据HTLV-1基因组的长末端重复区（LTR）以及env基因序列进行系统树分析，将来自日本、中东、美洲（包括加勒比地区）、非洲等地区的HTLV-1大致分为C、J、WA、CA和M 5个亚型。J亚型集中于日本，WA亚型分布于西非，CA亚型分布于中非，M亚型见于巴布亚新几内亚、所罗门群岛和澳洲土著人中，而C亚型则在中东、日本、美洲（包括加勒比地区）以及非洲某些地区均不少见，表现出一种与其它亚型明显不同的分布特点。由于C亚型在多个地区与其它当地亚型共存，但仍保持系统树上的明显独立分枝，因此推测C亚型的全球性分布是因某一携带病毒的共同祖先人群在近几百年内的远距离迁移造成的，但其源头究竟是何处迄今尚无定论。

　　在各亚型之间，C亚型与J亚型的距离最近，在系统树中的分界较不稳定，迄今仍有许多学者将C、J两个亚型视为一个亚型下的两个亚群，因此推测此两亚型可能是由某一共同祖先在不是十分遥远的过去分别进化而来的。Vidal等^［11］发现J亚型基本局限于日本及夏威夷的日本后裔。在日本还有25％左右的C亚型，但有趣的是这些C亚型几乎完全集中于日本南部的几个岛屿，而不象J亚型分布于全日本各个流行区，推测日本的C亚型可能是在近百年内才由其它地方传入。Chen等^［12］对台湾地区HTLV-1进行了分子遗传学研究，结果在几个部落的台湾高山族土著居民中均未发现HTLV-1感染，而岛内大陆移民及后裔中HTLV-1感染率在1％左右，其中C亚型占70％以上，其余为J亚型；在与大陆仅隔数海里的金门岛，HTLV-1感染率为0.73％，全部是C亚型，因此认为台湾的HTLV-1C亚型更可能是由大陆传入而非日本。本研究从与台湾隔海相望的福建沿海地区克隆出3株HTLV-1的env基因，其序列经系统发生树分析，确认为HTLV-1　C亚型，从而证实了中国大陆HTLV-1　C亚型的存在。由于台湾岛及金门岛内居民的大多数都是福建沿海地区居民的后裔，因此本研究为，Chen等的推测提供了进一步的证据。本研究所处地区毗邻明朝郑和七下西洋的出发地，同时也是清末海外华工的主要输出地之一，还是明朝倭寇出没之地，在近几个世纪以来对外人口迁徙频繁。另外，从地理位置来看，日本C亚型病毒分布地区基本上都与中国临近，是否C亚型病毒的全球性传播与此有关？中国是否是C亚型的源头？目前在我国广东、黑龙江、辽宁等地都已发现了多例HTLV-1感染者和ATL患者^［5－7］，马来西亚、菲律宾等也有HTLV发现^{［13，14］}，因此对这些地区以及山东沿海、朝鲜半岛、东南亚其它各国等地的HTLV-1的进一步病毒分子遗传学研究，将会对进一步判断这种可能性提供更多的重要证据。

　　HTLV-1的传播途径与HIV类似，可以通过哺乳或宫内垂直传播，同时还可通过输血、性接触、静脉药瘾者共用针头等进行水平传播。早在80年代，日本、美国等就陆续发现了几例由于输入HTLV感染血液而导致的HAM／TSP患者，因此日本、美国、法国、澳大利亚、香港、台湾及其他许多国家和地区都已陆续将HTLV感染检测列为献血员及血制品必检项目之一。我国也曾在福建沿海地区、广东沿海及内陆地区发现了HTLV流行区，人群感染率在1％左右^［2，5］。近年来在国内其他多个地区也陆续发现了HTLV的散在流行，例如：黑龙江省在1996年进行的抽样调查中发现采浆人群中HTLV感染率明显高于普通人群^［6］；河南省曾发现一例疑似受血导致的HTLV感染^［8］；福建省福清市医院对201例血液病患者进行检测，结果24例阳性，阳性率高达11.9％，据分析与血液病患者输血频繁有关^［3］。由于HTLV感染后果的严重性，随着我国各地HTLV感染的陆续发现，如何进一步加强对我国HTLV相关研究及制定相应的对策已成为一个迫切需要认真考虑的问题。

　　基金项目：教育部重点科技项目（99179）

　　作者简介：王颖彬（1975－），女，江西南昌，硕士研究生，研究病毒分子生物学。

　　参考文献：

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收稿日期：2000－04－11；修回日期：2000－05－22