亚硒酸钠对人白血病HL-60细胞作用机制的研究
中国病理生理杂志 1999年第8期第15卷 实验技术
作者：魏一生 叶庆林 金静君 林德馨 曹祖蕊 杨俐丽
单位：魏一生 金静君 曹祖蕊 福建省医学科学研究所(福州 350001)；叶庆林 林德馨 杨俐丽 福建医科大学
关键词：硒；白血病；细胞
摘 要 目的和方法：实验观察亚硒酸钠对人急性髓性白血病细胞系HL-60细胞生长增殖、诱导分化、细胞内自由基产生和清除系统以及胞内环核苷酸累积的影响，探索亚硒酸钠对人白血病HL-60细胞作用机制。结果：8×10-6mol/L或更高浓度的亚硒酸钠均可显著抑制HL-60细胞的生长增殖，作用5 d可在一定程度上诱导HL-60细胞向成熟粒细胞方向分化。8×10-6mol/L亚硒酸钠作用一段时间，可增强自由基清除系统酶活性，减低胞内自由基水平，降低细胞内cGMP累积而对cAMP累积无明显影响。结论：硒的抗白血病作用可能与亚硒酸钠的这些作用相关。
Possible mechanism of antileukemic effect of sodium selenite
WEI Yi-Sheng JIN Jing-Jun CAO Zu-Rui
1Fujian Institute of Medical Sciences (Fuzhou, 350001)
LIN De-Xin YANG Li-Li YE Qing-Lin
2 Fujian Medical University
Abstract AIM and METHODS:To study the mechanism of antileukemic effect of sodium selenite, the effect of sodium selenite on the growth of HL-60 cells, its differentiation to mature granulocytic cells, activity of enzyme for free radical production and for their clearance, and accumulation of cyclic nucleotide were examined.RESULTS：8×10-6mol／L-1.6×10-5mol／L sodium selenite inhibite significantly the growth of HL-60 cells, being dose dependent. Exposure to 8×10-6mol／L sodium selenite for 5 d induced differentiation of HL-60 cells in the direction of mature granulocytic cells to some extent. Exposure to 8×10-6mol／L sodium selenite for 1～5 d increase activity of enzymes for clearing of free radical( indicated by SOD), decrease the content of free radical in cells (indicated by mDA) as time passes on. Exposure to 8×10-6mol／L sodium selenite for 30 min has no effect on cAMP accumulation in cells either at rest or stimulated by adrenalin, but decreases cGMP accumulation and increases cAMP/cGMP ratio in the same time.CONCLUSION：It suggested that beside owing to a possible potential differentiation induction under certain circumstances, antileukemic effect of sodium selenite, may partially involve the increase of activity of enzymes for clearing free radical that cause decrease of free radical in cells.
MeSH Selenium; Leukemia; Cells
近年来的研究表明，硒有防止肿瘤发生、抑制肿瘤生长增殖、促进恶性肿瘤细胞逆转分化的作用［1～6］，但有关硒防治肿瘤的机制并未阐明。本研究实验观察亚硒酸钠抑制HL-60细胞生长增殖，促进其逆转分化的作用，同时观察亚硒酸钠对HL-60细胞的自由基产生和清除系统以及对细胞内环核苷酸累积的影响，探讨亚硒酸钠抗白血病作用的机制。
材料与方法
(一)人急性髓系白血病细胞系HL-60细胞(AML-M2型白血病细胞)的培养：HL-60细胞引自中国医学科学院药物研究所，以含10%新生小牛血清的RPMI1640培养液培养于二氧化碳培养箱(5%CO2，95%空气，饱和湿度)，每3～4 d传代1次。
(二)HL-60细胞生长曲线的绘制：取对数生长期HL-60细胞，以1×104／mL密度接种25 mL培养瓶，每瓶5 mL，置二氧化碳培养箱培养24 h后，实验组分别加8×10-4mol／L亚硒酸钠50或100 μL使终浓度分别为8×10-6mol／L和1.6×10-5mol／L，对照组加入100 μL完全培养液，均各两平行瓶。于加亚硒酸钠后1～9 d，每日从各瓶无菌取样50 μL，加同体积0.4%台盼蓝溶液混匀，以血细胞计数板计数活细胞，取各平行瓶的均值。重复3次。以培养时间为横坐标，活细胞数为纵坐标绘制生长曲线。
(三)HL-60细胞诱导分化的形态学观察：HL-60细胞按2×105／mL的密度接种于25 mL培养瓶，每瓶4 mL，共6瓶。实验组每瓶加3.2×10-4mol／L亚硒酸钠应用液0.1 mL，使终浓度为8×10-6mol／L，阴性对照组加同体积完全培养液，阳性对照组加DMSO使终度为1.25%。各两平行瓶。置37℃、5%CO2、饱和湿度环境培养5 d，于d 5以涂片离心机(北京医用离心机厂，LXT2.5型)制作细胞涂片，Wright染色，1 000×油镜下观察形态学改变，进行细胞分类计数。实验重复3次以上。由固定人员阅片。同样处理的细胞用于MDA、SOD和环核苷酸累积的测定。
(四)NBT反应：按参考文献［7］方法进行。
(五)MDA含量测定：硫化巴比妥钠酸(TBA)荧光法［8］，结果以nmol/mg pr表示。
(六)超氧化物歧化酶(SOD)活性测定：取样品加氯仿酒精混合液，混匀，3 500 r/min离心10 min，吸上清液，按Pyrogallol-NBT比色法测定［9］。
(七)环核苷酸累积测定：同批培养的HL-60细胞分别分为对照管和实验管，每管加3-异丁基1甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX)800 μmol/L，保温37℃， 30 min。然后，各实验管换含亚硒酸钠培养液，对照管换同体积的培养液，保持37℃，30 min离心1 000 r/min 5 min，弃上清，细胞团块加80%乙醇，以超声波匀浆器制成匀浆，供环核苷酸提取、测定和蛋白质测定。亚硒酸钠对静息的和肾上腺素(5×10-5mol/L)刺激的环核苷酸累积的实验和测定方法参考文献［4］，结果以pmol/106 cells.30 min-1表示。
(八)蛋白质测定方法：采用Lowry等方法，牛血清白蛋白(fraction V)作为标准品。
结 果
(一)亚硒酸钠对HL-60细胞生长、增殖的影响：亚硒酸钠8×10-6mol／L和1.6×10-5mol／L对HL-60细胞生长增殖均有显著影响(图1)。且呈剂量依赖性的抑制作用。
Fig 1 Effect of sodium selenite on the growth curve of HL-60 cells O: control; ●sodium selenite 8×10-6mol／L; ×:sodium selenite 1.6×10-5mol／L
图1 亚硒酸钠对HL-60细胞生长曲线的影响
(二)亚硒酸钠对HL-60细胞的诱导分化作用：亚硒酸钠(终浓度8×10-6mol／L)作用5 d可在一定程度上诱导HL-60细胞分化，出现细胞形态学的右移(表1)，NBT实验的阳性率增高。亚硒酸钠组NBT试验阳性率(50.75±6.72)%，与阳性对照组DMSO(55.50±16.26)%相近，而与阴性对照组(9.25±2.47)%差异非常显著(P＜0.01)。
表1 亚硒酸钠作用下HL-60细胞的形态学改变
Tab 1 Effects of sodium selenite on morphology of HL-60 cells (n=200)
| Group |
Morphology(%) |
| MB |
PM |
MY |
MM |
MG |
| Control |
42.0 |
45.0 |
12.1 |
0.9 |
0 |
| DMSO |
20.3 |
48.7 |
23.2 |
7.0 |
0.8 |
| Sod.selenite |
25.8 |
55.5 |
17.3 |
1.2 |
0.2 |
MB:Myeloblast PM:Promyelocyte, MY:Myelocyte,; MM:Metamyelocyte； MG:Mature granulocyte (including band form and segmented)
(三)亚硒酸钠对HL-60细胞自由基产生和清除系统的影响：8×10-6mol／L亚硒酸钠作用1、 3、 5 d，可见HL-60细胞自由基的产生量(以MDA为指标)随硒作用时间的加长逐步减少，而HL-60细胞对自由基的清除能力(以SOD活性为指标)则随硒作用时间的加长而逐步增高(表2)。
表2 亚硒酸钠对HL-60细胞MDA和SOD的影响
Tab 2 Effect of sodium selenite on level of MDA & SOD of
HL-60 cells (
±s，n=10)
| Group |
MDA(nmol/mg pr) |
SOD(U/mg pr) |
| Control |
0.833±0.034 |
7.870±0.544 |
| Sod.selenite |
|
|
| 1d |
d0.712±0.029* |
9.970±0.587** |
| 3d |
d0.696±0.025* |
10.280±0.442** |
| 5d |
d0.666±0.025** |
12.889±0.880** |
*P＜0.05, **P＜0.01, vs control
(四)亚硒酸钠对HL-60细胞静息的和肾上腺素刺激的环核苷酸累积的影响：亚硒酸钠(终浓度8×10-4mol／L处理30 min)对HL-60细胞静息的和肾上腺素刺激的cAMP累积均无明显影响，但可明显降低静息的和肾上腺素刺激的cGMP累积和增高cAMP/cGMP比值(P＜0.01)(表3)。
表3 亚硒酸钠对HL-60细胞静息的环核苷酸累积的影响
Tab 3 Effects of sod. selenite on cGMP & cAMP accumulation of HL-60 cells at rest or
stimulated by adrenalin (pmol/106, cells.30 min-1±s)
| R/S |
Group |
n |
cAMP |
cGMP |
cAMP/cGMP |
| R |
Control |
9 |
1.720±0.771 |
0.0762±0.0287 |
21.670±7.201 |
| |
Sod. selenite |
9 |
1.940±0.976 |
0.0619±0.0171 |
36.030±13.177** |
| S |
Control |
8 |
2.440±0.7490.072 |
0±0.01773 |
4.570±11.756 |
| |
Sod. selenite |
8 |
2.650±0.560 |
0.0581±0.0139 |
49.640±15.363** |
*P＜0.05,**P＜0.01, vs control; R: at rest; S: stimulated by adrenalin
讨 论
文献报道，硒具有防止肿瘤发生、抑制肿瘤细胞生长增殖和诱导分化的作用［1～6］。本研究证实，8×10-6mol／L浓度亚硒酸钠可显著抑制HL-60细胞的生长增殖，并诱导HL-60细胞的分化。8×10-6mol／L亚硒酸钠作用一段时间(1 d、3 d、5 d)，可增强自由基清除系统酶活性(以SOD活性为指标)，并减少细胞内自由基的产生量(以MDA含量为指标)，表明亚硒酸钠的抗白血病作用可能与其减少自由基的产生和增加其清除相关。文献报道［10］鸟苷酸环化酶是对自由基高敏感的酶，可为自由基所激活，同时鉴于肿瘤细胞较之正常细胞一般cGMP水平升高，从而认为cGMP是一个细胞增殖分裂的信号，而且一些作者的研究证明了亚硒酸钠的作用可使细胞内cGMP的合成减少［4，5］，cGMP水平降低［5，6］，cAMP/cGMP比值增大［4］。为此本文还研究了8×10-6mol／L亚硒酸钠对HL-60细胞静息的和肾上腺素刺激的环核苷酸累积的影响。试验结果表明，亚硒酸钠(终浓度8×10-6mol／L)对HL-60细胞静息的和肾上腺素刺激的cAMP累积均无显著影响，但明显降低cGMP的累积和增高cAMP/cGMP)的比值。本实验在亚硒酸钠处理前曾以磷酸二酯酶抑制剂IBMX处理细胞，所以cGMP累积的降低，只表明cGMP合成减少，即亚硒酸钠可抑制鸟苷酸环化酶的活性。综上所述，本研究结果表明，8×10-6mol／L亚硒酸钠的抗白血病作用，除了可能诱导分化外，还可能是藉其增强自由基清除系统的酶活性，使细胞内自由基清除加快，细胞内自由基水平降低，其结果引起鸟苷酸环化酶活性降低，导致细胞内cGMP合成减少，水平降低，从而起到抑制HL-60细胞的生长增殖的作用。
参考文献
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8 八木国夫.血清过酸化酯质の测定とその临床意义.临床病理，1981， 29：221.
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10 陈 媛，周 玫.氧化应激与原核基因表达的调控.生命的化学，1994， 14：3.
(1998年1月8日收稿，1998年11月5日修回)
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