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低分子核糖核酸对白血病细胞系HL-60细胞增殖的抑制作用

低分子核糖核酸对白血病细胞系HL-60细胞增殖的抑制作用

中国病理生理杂志 2000年第2期第16卷 短篇论著

作者:倪晓华 毕富勇

单位:(皖南医学院生物化学教研室,安徽 芜湖 241001)

关键词:RNA;胚胎;肝;白血病

  [摘 要] 目的:研究低分子核糖核酸(RNA)对白血病细胞系HL-60细胞增殖的影响。方法:采用胚胎肝细胞提取的低分子RNA掺入HL-60细胞培养。结果:低分子RNA掺入使HL-60细胞集落生长降低,并与掺入浓度呈负相关(r=-0.9435,P<0.01),细胞蛋白质含量降低(P<0.01),细胞形体缩小,FITC-ConA实验,帽状细胞数下降(P<0.01)。结论:低分子RNA对HL-60细胞的增殖有显著抑制作用。

  [中图分类号] Q279   [文献标识码] A

  [文章编号] 1000-4718(2000)02-0112-02

  [MeSH] RNA; Embryo; Liver; Leukemia

  Apirion等于1977年提出细胞核内合成的低分子RNA对基因表达具有抑制作用。Tomizawa发现反义核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)可抑制质粒脱氧核糖核酸(deoxyri-bonucleic acid,RNA)的复制,并可调节基因的转录和翻译。1979年Mary等已发现细胞质膜上存在有RNA,Benner于1987年提出“胞外RNA作为细胞间通迅物质”的设想,郑益星也提出动物胰组织RNA对瘤细胞增殖有抑制作用,本实验采用提取胚胎肝细胞的低分子RNA与HL-60细胞培养,以研究低分子RNA对白血病细胞系HL-60细胞增殖的影响。

材料

  HL-60细胞:本室传代培养,胚胎肝细胞组织:附院提供(11例)。

方法

  1.提取纯化细胞RNA 采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法抽提细胞总RNA。将胚胎肝细胞组织剪碎匀浆,制备细胞悬液,加入RNAase灭活剂乙基焦碳酸钠,再依次加入异硫氰酸胍、苯酚、氯仿、震荡混匀后,离心13 000 r/min弃上清,真空抽干,加入Tris-EDTA溶液,在752-型分光光度计测定核酸和蛋白的A值,计算RNA纯度A260/A280>1.9,于-70℃贮存备用。2.分离低分子RNA 将SephadexG50加入0.01 mol/L PBS,高压灭菌25 min,浸泡4 h装柱,吸取RNA提取液缓缓加在层析柱上,同0.01 mol/L PBS洗脱,洗脱液在254 nm时出现大小2个峰,分别收集,过滤除菌置-4℃冰箱贮存备用。3.HL-60细胞培养 ①悬液细胞培养 培养基为20%小牛血清的1640液于CO孵箱37℃培养72 h。②集落细胞培养 细胞终浓度为1×106/mL,培养基为2.5%甲基纤维素。掺入2 μg/mL低分子RNA,置96孔板作集落细胞培养,此为实验组,对照组则加0.01 mol/L的PBS液,于CO孵箱37℃培养96 h后作集落计算,大于15个细胞为1集落。每组作3孔,取平均值。③小峰组分浓度依赖实验 分别以0.50、0.75、1.25、2.5、5(μL)低分子RNA与HL-60作集落细胞培养。4.测定细胞蛋白含量 采用微量凯氏定氮法测定细胞蛋白含量。5.帽状(capped cell)细胞计数 将异硫氰酸荧光素FITC标记的伴刀豆球蛋白ConA与掺入低分子RNA的HL-60细胞作用15 min,在荧光显微镜下进行膜荧光细胞总数和capped细胞计数。

结果

  1.RNA的层析分离,得到大峰组分和小峰组分(图1)。2.低分子RNA对HL-60细胞集落生长有明显抑制作用,蛋白含量下降(表1),显微镜下观察,细胞明显瘦小,不规则。3.浓度依赖实验:掺入低分子RNA浓度分别为0.50、0.75、1.25、2.5、5(μL),细胞集落数则为146、136、120、104、90,而对照组则为150,经相关性检验r=-0.9435,P<0.01。4.FITC-ConA作用15 min后,对照组和实验组荧光细胞数为115、110,而帽状细胞数则为26和14,经χ检验P<0.01。

讨  论

  低分子RNA可透过细胞膜而进入胞内,作为反义RNA,通过碱基配对与mRNA分子结合,形成RNA=RNA的互补双链,从而阻止了RNA的胞内运输,并阻断mRNA的表达导致细胞内蛋白含量下降,有的学者认为反义mRNA阻滞HL-60细胞的GH-CSF的增殖信号,并在细胞增殖中具负调节因子的作用,本实验结果表明从胚胎肝细胞提取的低分子RNA对HL-60细胞的增殖有抑制作用,并且其抑制程度与低分子RNA浓度呈正相关,且由于低分子RNA的掺入,抑制了HL-60细胞的蛋白合成,说明低分子RNA的掺入对HL-60的基因表达有抑制作用。同时帽状细胞计数则表明低分子RNA通过降低ConA与细胞表面受体的结合率而降低了细胞帽的形成,本实验结果表明低分子RNA对HL-60细胞增殖有明显抑制作用,为临床上应用低分子RNA对白血病进行治疗提供了理论依据。

 Fig 1 Chromatographic seperation of RNA

  A:High molecular RNA; B:Low molecular RNA

1 RNA层析分离

表1 RNA对HL-60细胞集落生长及蛋白含量的影响

  Tab 1 The effect of RNA to colony growth and the content

  of protein (Pro) of HL-60 cell (±s,n=11)

  Control A B
The number

  of colony cell

140±15 128±20 66±13**
Content of

  Pro(μg/mL)

0.806±0.036 0.789±0.041 0.380±0.022**

  **P<0.01,vs control group

[参 考 文 献]

  [1] Potter AM, Watmore A. Cytogenetics in myeloid leukaemia [M].In:Human cytogenetics. ed. Vol Ⅱ. Oxford University Press:Oxford, 1992. 27.

  [2]Thibodeau SN, Schaid BD. Microsatellite instability in cancer of proximal colon[J]. Science, 1993, 260:816.

  [3] 周爱儒. 反义RNA[J]. 生命的化学,1991,11(3):14.

  [4] 郑益星. 胰RNA对瘤细胞作用的研究[J]. 生物化学与生物物理进展,1989,16(2):137~139.

  [5] 吴克复. 当前实验血液学的主要动向[J]. 中华血液学杂志,1991,12(3):157~159.

  [收稿日期]1999-03-31 [修回日期]1999-12-22


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