急性髓系白血病骨髓细胞体外长期培养中的纤维组织的动态变化
中国病理生理杂志 2000年第1期第16卷 论著
作者：林艳娟 吕联煌 陈志哲 李觉民 张萍容
单位：（福建医科大学附属协和医院， 福建省血液病研究所， 福建 福州 350001）
关键词：骨髓；细胞，培养的；白血病，髓样；胶原
［摘 要］ 目的和方法：为探讨急性髓系白血病细胞外基质纤维组织的动态变化对白血病细胞生长可能产生的影响。应用倒置显微镜及病理特殊染色(Gomori & Masson)观察15例AML骨髓细胞长期培养(LTBMC)贴壁层融合及网状纤维、胶原纤维含量(半定量法)的变化。结果：(1)8/15例获独立生长的AML(AMLsm)在培养的1～8周网状纤维含量显著低于正常对照和未获独立生长的AML(AMLnsm)(P＜0.05)。而AMLsm的胶原纤维含量在培养的1～6周显著高于正常对照和AMLnsm(P＜0.05)；(2)胶原丰富区域见大量造血细胞，而网状纤维密集区造血细胞稀少。(3)培养过程中贴壁层呈大部分融合的仅见于3例AMLsm。结论：适量的纤维组织是造血细胞生长所必需的，而其组成比例异常可能在白血病及其它一些恶性血液病的发生上起一定的作用。
［中国分类号］ R733.7 ［文献标识码］ A
［文章编号］ 1000-4718(2000)01-0063-04
Dynamic change of the reticulin fibres and collagen fibres in vitro long-term bone marrow culture of acute myeloid leukemia
LIN Yan-juan, LU Lian-huang, CHEN Zhi-zhe, LI Jue-min, ZHANG Ping-rong
(Fujian Institute of Hematology, Union Hospital Affiliated Fujian Medical University, Fuzhou 350001，China)
［Abstract］ AIM and METHOD: The relationship between the evolution of the reticulin fibres(RF) or the collagen fibres(CF) and the growing of hematopoietic cells in long-term bone marrow culture (LTBMC) from 15 paticnts with acute myeloid leukemia (AML) and form 6 normal subjects was observed by inverted microscope, Gomoris staining and Massons staining were used. RESULTS: (1)The amount of RF contents of 8 AMLs,with self- maintained(AMLsm) in the 1～8 weeks-old-culture was significant less than that of normal control and 7 AMLs,without self-maintained(AMLnsm) (P＜0.05). On the contrary,the amount of CF coutents of AMLsm in the 1～6 weeks-old-culture was significant more than that of normal and AMLnsm(P＜0.05). (2) There were many hematopoietic cells in the areas of CF, and there were few in the areas of RF. (3)During the whole culture, the most part of confluence of the adherent layer only observed in 3 AMLsm. CONCLUSION: A proper amounts of fibres in the extracellular matrixes of bone marrow is necessary for hematopoiesis, but the change of the proportion of RF contents to CF contents may play an important role in the development of AML and other malignant blood diseases.
［MeSH］ Bone marrow; Cells, cultured; Leukemia, myeloid; Collagen
近年来研究表明白血病造血微环境存在异常，其中纤维组织增生日益受到关注［1～3］。但对其异常的原因尚无明确的解释。本文通过对急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)骨髓细胞的长期培养，动态观察它们贴壁层纤维组织：网状纤维(reticulin fibres, RF)和胶原纤维(collagen fibres, CF)含量(半定量法)及分布的演变过程。旨在了解纤维组织作为骨髓细胞外基质的一大成份，其消长变化在白血病细胞的生长过程中可能产生的影响。
材 料 和 方 法
一、骨髓细胞来源：
15例初治AML均符合法、美、英(France, American and Britain, FAB)3国协作组的诊断标准。男10例，女5例，中位年龄25(14～55)岁。AML中M1 1例，M2 3例，M3 2例，M5 9例。健康志愿者6例，中位年龄36(25～52)岁。骨髓细胞标本均取自髂后上棘。
二、骨髓细胞长期培养(LTBMC)方法［4］：
培养至7、8周后，悬浮细胞增多的病例，按2×106/mL浓度将悬浮细胞移种于上述相同培养体系中，能继续传代不断生长者认为是获独立生长(self-maintainted,SM)。
三、贴壁层融合观察：
倒置显微镜下每周动态观察贴壁层纤维细胞生长、融合程度。融合判断标准：完全融合(占孔底面积3/4以上)；大部分融合(占孔底面积1/2-3/4)，小部分融合(占孔底面积1/2以下)。
四、贴壁层RF、CF染色、分级定量法：
(1)标本取自培养的第1,2,3,4,6,8周事先置孔底的盖玻片(贴壁层)用0.01 mol/L,pH 7.2的PBS轻漂洗2次后，分别用10％甲醛液或Bouin氏液固定。
(2)Gomori染色［5］：用10％甲醛液固定标本染色观察网状纤维。
(3)Masson染色［5］：用Bouin氏液固定标本染色观察胶原纤维。
(4)RF、CF分级标准参照Manoharan等改良法［6］略加修改，简述如下：
①RF分级标准：(-)无黑色纤维；(+)小部分区域*有纤细纤维网络；(++)大部分区域*细纤维网络和或有少许*粗纤维；(+++)大部分区域细纤维网络，且有小部分区域粗纤维；(++++)大部分区域或弥漫*的粗纤维网络。②CF分级标准：(-)无绿色纤维；(+)有少许*绿色纤维；(++)小部分区域*的绿色纤维；(+++)大部分区域*的绿色纤维；(++++)弥漫的绿色或深绿色纤维。
*注：以一个高倍视野(40×10倍)为一个区域，“少许”指1/4视野以下；“小部分区域”指1/4～1/2视野，“大部分区域”指1/2-3/4视野，“弥漫”指3/4至布满整个视野。
(5)含量以半定量积分计算法：共对200个高倍视野(10×40倍)分级，平均计算100个视野的积分量(阳性指数)。并观察RF、CF分布及其与造血细胞粘附的动态变化。
五、统计方法：
数据以均数±标准差形式表达。显著性检验用方差分析，q检验。
结 果
一、AML及正常对照细胞生长特点：
(1)每周半量换液前计数悬浮细胞数，发现于培养6至8周后8/15例AML悬浮细胞数渐增加，最终获独立生长(AMLsm)，另7/15例AML和6例正常对照未获独立生长(AMLnsm)，其悬浮细胞数明显减少而不能维持生长。
(2)观察贴壁层融合程度和时间：发现6例正常对照均于培养的3～4周完全融合；AML中8例于培养的2～3周完全融合(其中AMLsm 3例，于培养的5～8周转为大部分融合)，3例为大部分融合，仅见于AMLsm，4例为小部分融合。8周后AMLsm的贴壁基质融合层随造血细胞的增多，逐渐分离，纤维组织渐减少、消失。
二、AML及正常对照的RF含量变化：
AML及正常对照的RF含量(见表1)均随培养时程逐渐增加，AMLsm组1～8周RF含量均显著低于正常对照组和AMLnsm组(P＜0.05)； 而AMLnsm组RF含量1～2周低于正常对照组(P＜0.05)， 而3～8周与正常对照组无明显差异（P＞0.05）。
表1 各组网状纤维(RF)含量的变化(半定量积分)
Tab 1 The contents of reticulin fibres (RF) in different groups (integral half-quantitative, 
±s)
| Group |
n |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
6 |
8(weeks) |
| Control |
6 |
0 |
31.67±4.46 |
61.83±6.21 |
74.33±12.79 |
92.00±28.31 |
137.00±21.39 |
135.50±32.10 |
| AMLnsm |
7 |
0 |
18.57±4.58* |
42.14±9.15* |
70.57±9.31 |
80.14±15.95 |
125.14±18.21 |
113.86±26.00 |
| AMLsm |
8 |
0 |
5.75±4.77* |
13.88±10.75* |
26.50±16.47* |
34.63±19.91* |
50.50±32.70* |
30.63±16.89* |
*P＜0.05, vs control group; AML:actue myeloid leukemia; AMLnsm:no self-maintained;AMLsm:self-maintained
0～8 weeks:culture from the first to eight weeks 三、AML及正常对照的CF含量的变化：
AML及正常对照组的CF含量(见表2)均随培养逐渐增加，AMLsm组1～6周CF含量均显著高于正常对照组和AMLnsm组(P＜0.05)，AMLnsm组与正常对照组1～8周均无明显差别(P＞0.05)，第8周三组均无差别(P＞0.05)。
表2 各组胶原纤维(CF)含量的变化(半定量积分)
Tab 2 The contents of collagen fibres (CF) in different groups (integral half-quantitative, ±s)
| Group |
n |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
6 |
8(weeks) |
| Control |
6 |
0 |
13.00±4.94 |
42.67±14.68 |
57.00±7.62 |
70.00±11.31 |
92.33±22.22 |
96.50±16.39 |
| AMLnsm |
7 |
0 |
13.14±4.81 |
33.86±13.51 |
51.29±13.26 |
70.29±22.12 |
89.71±21.41 |
93.14±14.78 |
| AMLsm |
8 |
0 |
21.63±6.02* |
92.88±31.42* |
105.63±29.87* |
134.00±27.13* |
148.13±29.78* |
79.50±28.95 |
*P＜0.05, vs control group or AMLnsm group 四、观察RF、CF与造血细胞分布的关系发现：
Masson染色下，CF(绿色)丰富的区域，造血细胞生长密集(见图1)，且可见造血细胞粘附甚至被包裹于CF中(见图2)。Gomori染色下大量RF(黑色)存在的区域，造血细胞稀少，见到的多为纤维细胞(见图3)。在正常对照组、AMLnsm组和AMLsm组均观察到上述类似现象，各组间无明显不同。
讨 论
骨髓纤维组织主要包括RF和CF，由网状细胞和成纤维细胞合成，它们是一种纤维蛋白的不同形态表现，均属于胶原系统的物质，RF即Ⅲ型胶原，形成的纤维较细；CF即Ⅰ型胶原，其外被蛋白质和多糖的基质粘聚成较粗的纤维［5，7］。
虽然已发现恶性血液病骨髓纤维组织增生明显［1，2］，其机制尚不清楚。本实验对AML患者骨髓细胞体外长期培养，发现AMLsm和AMLnsm两个增殖不同的细胞群，它们的细胞外基质RF、CF的含量和比例有明显的差异，获独立生长组的CF含量明显高于正常对照和AMLnsm，而RF却明显低于正常对照和AMLnsm，且CF多的区域有大量造血细胞生长。提示纤维组织成分比例的改变可能影响造血细胞的增殖状态，参与白血病的发生、发展。Basson等研究提出Ⅰ型胶原纤维能促使癌细胞增殖速度加快［8］。
Fig 1 There are much collagen fibres(CF) (green) around the mass of hematopoietic cells by Masson's staining (10×10)
1 Masson染色下见造血细胞团周围有大量胶原纤维(10×10倍)
Fig 2 There are many hematopoietic cells adhered to CF (green), or were encapsulated in CF by Masson's staining (40×10)
2 Masson染色下见造血细胞粘附甚被包裹于胶原纤维中(40×10倍)
Fig 3 There are few hematopoietic cells at the RF(black) area by Gomori staining (40×10)
3 Gomori 染色下见大量网状纤维(黑色)区域，造血细胞稀少(40×10倍)
另一结果发现LTBMC中贴壁层呈适当融合（大部分融合）的AML易于获独立生长。其可能原因：⑴过量的纤维组织不利于造血的维持；⑵一定量的纤维组织具有起支架、粘附造血因子作用［9］，参与形成“龛”样结构，局部调控促进造血；(3)白血病细胞可自分泌许多细胞因子，不仅促进其自身生长，尚可影响基质细胞的合成和分泌功能，如成纤维细胞合成和分泌IL-1α调节胶原酶和基质溶解素的合成［10］，限制了贴壁层纤维组织的过渡增生。
本实验观察结果与张志宏等［2］对临床血液病患者骨髓纤维组织观察报告是相一致的。所不同的是LTBMC中观察是体外的动态过程；临床病人骨髓活检是某一瞬间的状态。应用LTBMC观察AML细胞从接种到最后获独立生长，贴壁层纤维组织的变化是：
消失｜←1～2W→｜←2～8W→｜←8W后→
6～8周是AMLsm细胞数渐增多并释放到悬液中的时间，此期AMLsm贴壁层纤维组织较多。临床上诊断MDS和急性白血病时，有些病例骨髓纤维组织明显增生是否正处此期以及AML的发生、发展过程中体内纤维组织变化是否经历类似于上述LTBMC中变化过程尚待进一步验证。
(致谢：本课题纤维组织的特殊染色工作得到本院病理科杨发端教授、陈维珠老师的指导与帮助，在此表示感谢)
［参 考 文 献］
［1］ 夏利军, 张春源, 翁维权. 血液病患者骨髓纤维化观察［J］. 中华血液学杂志，1990，11:355～357.
［2］ 张志宏, 范嘉琏, 石国英, 等. 血液病患者骨髓纤维组织和骨小梁变化的观察［J］. 中华血液学杂志,1993, 14:468～471.
［3］ Greenberger JS. Is the marrow stroma of AML patient a “leukemic” stroma［J］? Exp Hematol, 1992，20:1041～1042.
［4］ 林艳娟, 吕联煌, 陈志哲, 等. 急性髓系白血病细胞外基质Fn, Lm的分析及临床意义［J］. 中华血液学杂志, 1999, 20:36～39.
［5］ 凌启波. 结缔组织和肌纤维［M］. 见：凌启波主编. 实用病理特殊染色和组化技术.第1版. 广州：广东高等教育出版社，1989. 4～18.
［6］ 浦权.常用染色技术［M］. 见：浦权编著. 血液病骨髓组织病理学彩色图谱. 第1版. 天津:天津科学技术出版社, 1990. 11～12.
［7］ Montes GS. Structural biology of the fibres of the collagenous and elastic systems［J］. Cell Biol Int, 1996, 20:15～27.
［8］ Basson MD, Turowski G, Emenaker NJ. Regulation of human (Caco-2) intestinal epithelial cell differentiation by extracellular matrix proteins［J］. Exp Cell Res, 1996,225:301～305.
［9］ Maley MAL, Davies M, Grounds MD. Extracellular matrix, growth factors, genetics: their influence on cell proliferation and myotube formation in primary cultures of adult mouse skeletal muscle［J］. Exp Cell Res, 1995, 219:169～170.
［10］ Zeng G, Millis AJT.Differential regulation of collagenase and stromelysin mRNA in late passage cultures of human fibroblasts［J］. Exp Cell Res, 1996, 222:150～156.
［收稿日期］ 1998-09-08 ［修回日期］ 1999-01-11
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