反义治疗与白血病靶基因研究进展

中国病理生理杂志 2000年第8期第16卷 综　　述

作者：李文瑜　张洹

单位：(暨南大学医学院血液病研究室, 广东 广州 510632)

关键词：寡核苷酸， 反义；白血病；基因,抑制

　　［中图分类号］　 R733.7 　 Q786　　　［文献标识码］　A

　　［文章编号］　1000-4718(2000)08-0764-05

Advanced studies on antisense oligonucleotide treatment

　　and target-gene of leukemia

LI Wen-yu,　 ZHANG -Yuan

　　(Institute of Hematological Disease, Medical College of Jinan University,Guangzhou 510632, China)

　　［A Review］　The oncogene expression and growth of leukemic cells could be inhibited by antisense oligonucleotide. The selection of target genes is the key step in the research of antisense oligonucleotide on leukemia. The article would review the status and prospect of some target genes of leukemia in the investigation of antisense oligonucleotide.

　　［MeSH］　 Oligonucleotides,antisense; Leukemia; Genes,suppressor

　　反义技术是根据碱基互补原理，利用与目标靶DNA或RNA互补的短链片断封闭基因表达。反义技术用于抗白血病的理论基础，是用反义核酸中止原癌基因或癌基因的表达，使白血病细胞分化或凋亡，达到治疗的目的。其特点是，特异性强，对正常细胞无明显影响。反义核酸能在核酸水平上抗白血病，优于在蛋白水平的作用。基本内容包括：反义RNA、反义DNA、核酶（ribozyme）和三股螺旋DNA（DNA－Triplex）。主要通过下列作用之一或联合作用抑制靶基因表达：1.与双链DNA形成三链结构，使DNA转录受阻。2.结合靶mRNA，形成双链结构，激活核酶，降解靶mRNA或使靶mRNA翻译终止。3.使细胞表达核酶，降解特定基因片段。4.阻挡mRNA前体由核向胞浆转运或成熟，间接影响基因表达。急慢性白血病反义治疗的靶基因包括融合基因、点突变基因、正常基因、以及扩增基因。随着人类基因组计划的进行，新的基因会越来越多，基因靶点会越来越多，为反义技术带来广阔的前景。现就上述基因进行综述。

　　一、靶基因

　　1. 融合基因bcr/abl

　　慢性粒细胞白血病（chronic myelogonous leukemia, CML）细胞遗传学特征是胞内存在Ph染色体，大约95％CML患者Ph染色体阳性。Ph染色体是9号染色体上的c-abl原癌基因易位到22号染色体断裂点簇集区bcr，形成bcr/abl融合基因。根据bcr断裂点位置不同，此融合基因主要存在2种类型：bcr2/abl2（b2/a2，也称l-6型）和bcr3/abl2（b3/a2，也称k-28型），二者仅相差75 bp，都编码一种P210蛋白。它比c-abl编码的P145有更强的酪氨酸激酶活性，为CML发病基础，能在体外转化造血细胞，诱导CML。bcr/abl融合基因为CML特异的，DNA序列单拷贝，并且较稳定，理论上适合作反义治疗^［1］。

　　1991年，Szezylik等^［2］研究了反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, ASON）对CML的影响。5例l-6型CML患者白血病细胞，被针对b2/a2（l-6型）ASON（5’-GAAGGGCTTCTTCCTTAT-3’）不同程度抑制，抑制率60%～90%；5例k-28型CML患者白血病细胞，被针对b3/a2（k-28）ASON（5’-GAAGGGCTTTTGAACTCT-3’）抑制，抑制率60%～80%，与l-6型结果相似。正常骨髓细胞与CML骨髓细胞1∶1比例混合，与断裂点特异的ASON一起培养12 d后，与未加入ASON的对照组相比，CML的骨髓细胞克隆数明显减少，而正常骨髓细胞克隆数无变化。说明ASON对正常细胞无抑制作用。若在k-28型CML中加入l-6型ASON，仅有2.5%～5％细胞生长被抑制，与未加入ASON组无明显差异，针对bcr/abl不同断裂点，ASON特异地抑制其细胞生长。

　　许多作者发现，ASON抑制CML细胞生长，是ASON引起CML凋亡的结果^［3］。凋亡机理部分作者认为与ASON下调bcl-2(b-cell lymphoma/leukemia-2)表达有关^［4］。

　　Skorski等^［5］，给SCID(severe combined immunodeficent)鼠输注CML急变细胞系BV173，造成与人CML相似的动物模型。白血病小鼠输注bcr/abl ASON，1 mg/d，连用9 d，发现白血病细胞克隆消失, bcr/abl mRNA明显降低。而未经ASON输注的小鼠，8～13周死于白血病。输注ASON小鼠，18～23周才死亡。

　　CML细胞经bcr/abl ASON处理后，生长受抑，而对正常细胞无影响。人们开始进行CML自体骨髓移植的体外净化工作。

　　Fabrittis等^［6］对加速期和第二次缓解期CML患者进行ASON(b2a2：5’-CGCTGAAGGGCTTCTTCCTTATT-GAT-3’；b3a2：5’-CGCTGAAGGGCTTTTGAACTGTGC-TT-3’)体外净化及自体骨髓移植。1例因CML急性变，自体骨髓移植后7个月死亡；3例移植后21～39个月急性变，1例移植30个月死于非移植相关疾病；3例移植维持缓解期达14～26个月。患者都曾出现过血液学完全缓解及生存期延长，鼓励人们继续这方面工作，将会发现更加特异有效的ASON，从而进一步提高患者生存率。

　　随着bcr/abl ASON作用于CML研究的深入，出现越来越多的矛盾现象。针对b2/a2的融合基因ASON经MTT法证实对含有b3/a2融合基因K562、Ba/F3的细胞株有明显抑制作用（可达50%），同样对含有b2/a2融合基因的BV173也有抑制作用。抑制P210蛋白表达，恢复P145蛋白表达。HL-60细胞株作为对照组，ASON对其无抑制作用^［7］，说明ASON抑制作用无顺序特异性。推测ASON与靶mRNA部分结合，激活RNA Hase, 其作用非顺序特异性，导致靶mRNA断裂。目前还没有合理解释。但却提示在设计ASON时，不仅应针对断裂点，还应尝试对bcr/abl mRNA的其它序列。

　　此外，CML为克隆性疾病，而bcr/abl在干细胞中无表达，因此有作者认为bcr/abl不是CML的真正靶基因^［8］。

　　相信对CML 发病机制的进一步探讨，人们将会尽快找到真正特异性序列的靶基因。

　　2. 点突变

　　p53基因定位于染色体17P13.1区，为一种抑癌基因。分为野生型、突变型。突变型在很多情况下是野生型发生点突变而致，它不具备抗细胞增殖作用，与肿瘤发生相关。故合成与突变型p53互补的ASON可能抑制白血病细胞的增殖。

　　在体外实验中，急性髓细胞白血病（acute myelogenous leukemia,AML）细胞株，针对p53第10个外显子的ASON，能明显降低白血病细胞的增殖；同时把加入ASON 的AML患者白血病细胞，与未加入ASON者对比，细胞减少90%^［9］，而对正常细胞无抑制作用。

　　Bishop等^［10］合成p53 ASON ［5’-d(CCCTGCTCCCCCCTGGCTCC)-3’］进行体内实验。6例难治性AML、10例进展中骨髓增生异常综合症，给予p53 ASON，0.05～0.25 mg*kg^-1*h^-1,连用10 d，发现对患者骨髓白血病细胞有明显抑制作用，但未能使白血病细胞消失，无1例完全缓解。其中1例骨髓增生异常综合症患者，进展为AML。经蒽环类化疗药物加阿糖胞苷标准化疗方案化疗，达完全缓解。再经大剂量阿糖胞苷巩固治疗，完全缓解期达1年。化疗效果明显提高。

　　在最适浓度、条件下，此种ASON仅能使白血病细胞减少1/10 ～1/100^［19］。其抑制白血病细胞增殖主要依赖于急性DNA损伤。因此，推测与蒽环类、足叶乙甙等导致DNA损伤的化疗药物联合应用，也许有协同作用，提高杀伤效果。在体外实验中证实，此种ASON与蒽环类化疗药有相互协同作用^［11］。这为p53反义治疗带来一些希望。

　　3. 正常基因

　　有些正常基因对维持白血病细胞的表型、生长、增殖有重要作用，而对正常造血干细胞生长、分化的作用，不如前者。因此也作为反义治疗靶基因，如CML中的原癌基因c-myb, 它是被最早进行反义治疗研究的原癌基因之一。

　　c-myb定位于6号染色体，编码一个75 kD核结合蛋白myb，是细胞周期G/S中重要转换基因。

　　c-myb参与正常造血调控，具有调控多种造血祖细胞功能，尤其对晚期造血祖细胞更重要^［12］。但普遍存在于白血病细胞系，并且ASON抑制myb表达，抑制白血病细胞增殖^［13］，说明c-myb 表达对白血病细胞同样必要。并发现白血病细胞系生长比正常细胞对c-myb更敏感^［14］。

　　Ratajczak等^［15］合成的myb ASON，与11例CML患者的骨髓或外周血白血病细胞共同孵育24 h。有4例处于急变期，ASON均能明显抑制CML克隆形成；有7例处于慢性期，其中4例CML克隆明显被抑制。白血病克隆遭到抑制的8例患者，经RT-PCR发现其中6例的bcr-abl mRNA完全消失。慢性期患者bcr-abl mRNA完全消失意味着治愈的可能性，并提示人们是否可将c-myb 用于CML体外净化工作。同时说明c-myb 能够调节bcr-abl基因表达。c-myb、bcr-abl ASON联合应用可能会提高CML反义治疗水平。

　　c-mybASON抑制白血病细胞增殖可能与G/S期阻滞有关。此外，有些作者发现c-myb调控c-kit基因表达，为其上游基因。c-kit编码造血细胞上的酪氨酸激酶受体，酪氨酸激酶与细胞生长、增殖有关^［27］。c-kit功能受抑时，造血细胞发生凋亡^［16］。故c-mybASON封闭myb表达，c-kit下调，造血细胞发生死亡。

　　4. 扩增基因：

　　反义治疗的靶基因还包括扩增而过度表达的基因，如bcl-2及多药耐药基因（multidrug resistence gene,mdr-1）。

　　bcl-2为原癌基因，定位于染色体18q21,它编码一种26 kD的线粒体的膜蛋白，目前发现这种膜蛋白也存在于核膜及内质网膜上。bcl-2第一次被发现，是因在淋巴瘤中普遍存在t（14；18）染色体易位，这种易位使IgH与bcl-2形成融合基因，bcl-2基因表达失控，bcl-2蛋白高表达。严格来讲，bcl-2不属于扩增基因。在白血病细胞中虽无bcl-2染色体易位，但bcl-2蛋白常常高表达。

　　bcl-2能够抑制造血细胞因热刺激、射线、化疗药物、撤消生长因子等多种因素引起的细胞凋亡^［17］。白血病细胞中，bcl-2高表达者，对化疗反应差，缓解期短，存活时间短^［18］。因此，降低bcl-2表达水平，也许能促进白血病细胞凋亡，增加对化疗药物的敏感性。

　　曹国栋等^［19］，将逆转录病毒作为载体，把正义bcl-2、 反义bcl-2分别转入Jurkat细胞中。经Western blot 检测，转导反义bcl-2序列能明显抑制Jurkat细胞的bcl-2蛋白表达。两种细胞再分别加入足叶乙甙，经流式细胞仪检测，转入反义bcl-2 的Jurkat细胞在G₁期前出现二倍体峰比率为39%，而对照组仅8.8%。而且转入反义的bcl-2 Jurkat细胞DNA电泳，梯状DNA片段量明显增加。可见反义bcl-2增强了足叶乙甙促白血病细胞凋亡作用。Keith等^［20］合成bcl-2 ASON，使17例bcl-2高表达、对化疗不敏感的AML病人中，7例的白血病bcl-2基因表达明显下降，从而使这些原始细胞对阿糖胞苷诱导的凋亡敏感性增加。

　　最近有些研究发现^［21］，人类B-REH细胞表达高水平bcl-2，但对足叶乙甙、阿霉素等化疗药物保持相当敏感性；而HL60细胞表达相对低bcl-2水平，但对化疗药物抵抗性较强。这与上述实验结果相反。究其原因，bcl-2在70位丝氨酸经蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)磷酸化，才能发挥其作用。虽HL60细胞bcl-2较低，但bcl-2磷酸化水平、PKC表达水平较高，因而HL60 bcl-2抗凋亡作用较强。提示我们可否通过PKC ASON降低bcl-2表达，从而增加对化疗药物敏感性，甚至疗效更高。

　　此外，在bcl-2家族中，有促凋亡基因（bax、bad、bcl-xs）及凋亡抑制基因（bcl-2、bcl-xl），其中bcl-2/ bax比率更能反映白血病细胞对化疗药物促凋亡作用的敏感性^［22］，因而设计bcl-2 ASON，也应考虑bax的因素。

　　多药耐药基因mdr-1过度表达是多药耐药产生的主要机制，也是白血病化疗失败的主要原因之一。mdr-1编码一种P170糖蛋白，能够把多种结构、作用机制不同的化疗药物从细胞内“泵”出到细胞外，使细胞内药物浓度减低，产生耐药性。

　　Motomura等^［23］合成mdr-1 ASON［mdr-1-AS（ASON 5’-TTCAAGATCCATCCCGACCTCGCG-3’）、 mdr-1-S（sense 5’- CGCGAGGTCGGGATGGATCTTG-AA-3’）］抑制P170糖蛋白表达，逆转多药耐药性。K562/ADM多药耐药P-170⁺细胞株给予mdr-1-AS，20　μmol/L时，P-170⁺细胞比率由100%降至26%；2.5 μmol/L时降至69%。并且mdr-1 mRNA表达水平、排除细胞内药物的能力均下降。而mdr-1-S无上述作用。K562/ADM细胞加入柔红霉素及mdr-1-S或mdr-1-AS后，mdr-1-S组柔红霉素对细胞90%抑制浓度，为mdr-1-AS组的5.9倍。可见mdr-1 ASON能逆转耐药性，增强耐药细胞株对化疗药物敏感性，并且对正常细胞无抑制作用。

　　为进一步评价mdr-1 ASON［ mdr-1 ASON（5’-GTCCCCTTCAAGATCCAT-3’）， mdr-1-S（5’-ATGGATCTTGAAGGGGAC-3’）］逆转耐药性在体内的情况。mdr-1 ASON、 mdr-1-S被分别输注给转染了HL60/长春新碱(vincristine,Vinc)耐药细胞株SCID鼠，1 mg/d,连用10 d；及输注Vinc，20 mg/d, 连用3 d。转染了HL60/Vinc耐药细胞株SCID鼠，中位生存期56 d；输注Vinc后，中位生存期70 d；若再输注mdr-1-S，中位生存期77 d，三者生存期无统计学差别。而此种鼠输注Vinc及mdr-1 ASON，中位生存期300d，与上述三者有明显差异^［24］。因而输注mdr-1 ASON是一种非常有希望的逆转耐药性的方法。

　　对比mdr-1耐药细胞系及患者白血病细胞，发现为逆转多药耐药，患者白血病细胞需要更高浓度的ASON，这可能与患者白血病细胞的耐药倍数低有关^［23］。但Zhao等^［25］发现同一种ASON，白血病细胞对其吸收能力强于正常细胞。

　　但有些作者^［26］认为，反义技术并不能完全封闭mdr-1表达，归因于细胞内mdr-1 mRNA的数量之大和良好稳定性。mdr-1 ASON只能使总P170合成下降。P170－部分存在于细胞膜上，发挥多药耐药功能，一部分存在于细胞浆内，与多药耐药无关，但却是细胞膜P170储存库，能保持细胞膜上P170水平的稳定。因此不完全封闭mdr-1 ，很难逆转多药耐药。这与上述观点相矛盾。因此，有的作者考虑从其它方面，降低P170表达，逆转耐药性。同bcl-2蛋白相似，P170发挥耐药性功能，也需PKC的蛋白磷酸化作用。王向阳等^［29］在人肺癌细胞株LTEPa-2，成功地运用PKC ASON 降低了mdr-1基因表达，逆转耐药性。

　　mdr-1不仅存在于白血病细胞上，也存在于正常细胞上，如骨髓造血干细胞CD34⁺、肠道及肝脏等组织。mdr-1 ASON作用于靶细胞时，也有可能作用于上述正常细胞，产生副作用。设计mdr-1 ASON时应考虑靶向性，如与单克隆抗体联用，导向治疗。

　　bcl-2、mdr-1二者从不同方面介导耐药性，在以后的实验中，是否可联合应用二者的ASON，逆转耐药性。

　　二、问题与展望

　　以上列举了几种常见癌基因的反义治疗，在体外实验及裸鼠体内均能明显抑制癌基因表达，但仍未能广泛应用于人体，主要原因如下：

　　1． ASON在胞浆中易被核酶降解，半衰期短，稳定性差，常用化学修饰法增加其稳定性。如核酸骨架被肽核酸、N3’-P5’酰基磷酸取代，核酸骨架的磷酸基被硫代磷酸、甲基磷酸，但都有其不足之处，希望能尽快找到新的修饰法。

　　2．ASON合成价格昂贵，还未能用于临床。

　　3．白血病发病过程复杂，多个癌基因同时或在不同阶段促进细胞发生恶性转化。因而抑制单个基因，还不能对白血病细胞产生足够大的影响。反义技术针对多个基因联合应用，也许能提高疗效。有些作者已开始从事这方面的工作，联合应用c-myc、bcr/abl ASON取得了比单独应用更高疗效^［28］。这方面的工作仍须继续开展。

　　随着人们对白血病发病机制进一步深入了解，基因工程技术手段不断完善，反义技术无疑是人们战胜白血病的新希望。

　　［基金项目］ 国家自然科学基金(No.39870361); 广东省重点科技项目(99M1204G)资助

　　Tel: 020-85225861

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［收稿日期］ 2000-01-10　　　［修回日期］ 2000-03-29