G-CSF对急性髓系白血病细胞P-糖蛋白表达的调节作用研究

中华血液学杂志 1998年第2期第19卷 研究报告

作者：安峻峰　陈济民　李秀珍　梅广义　谢燕　高清平　夏宏

　　通过诱导分化剂调节白血病细胞原发性P-糖蛋白(P-gp)表达，国内外罕见报道。我们用粒系集落刺激因子(G-CSF)诱导急性髓系白血病(AML)细胞分化，观察了细胞分化与P-gp调节之间的关系。

材料和方法

　　1　对象　经FAB分型确诊的初诊AML患者31例，其中M₁2例，M₂8例，M₃7例，M₄6例，M₅8例；男18例，女13例；年龄16～63岁。正常人3名。

　　2　主要试剂　G-CSF由日本麒麟公司惠赠。抗P-gp单克隆抗体(单抗，JSB-1)、SP检测试剂盒和DAB显色试剂盒购自福建迈新公司。多药耐药细胞系K562/VCR和敏感细胞系HL-60细胞涂片由中国医学科学院血液学研究所杨纯正教授提供。单抗CD_11b、CD₃₄由军事医学科学院基础所提供。CD₁₃、CD₁₄、CD₁₅、CD₃₃由中国医学科学院血液学研究所免疫室提供。碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APAAP)检测试剂盒由卫生部武汉生物制品所提供。

　　3　白血病细胞分离、培养和实验分组　白血病细胞均在患者就诊时取自骨髓，按常规方法分离白血病细胞并配成单个核细胞(MNC)悬液，按5×10⁶/ml浓度接种于以下各组培养瓶中，并分别加入以下各药：①组：空白对照，只添加含15%小牛血清的IMDM培养液；②组：G-CSF终浓度20ng/ml(参照文献［1］并由预备试验确定)，然后置于37℃，含5%CO₂的饱和湿度培养箱中培养7天，每组重复4瓶。

　　4　细胞形态及细胞化学　按本室常规进行Wright-Giemsa及α-醋酸萘酚酯酶(α-NAE)及氯醋酸萘酚酯酶(AS-DCE)染色。

　　5　四氮唑蓝(NBT)还原试验　参照Collins 的方法^［2］并作改进，随机计数200个细胞，胞浆内见紫黑色甲月　替沉积为阳性。

　　6　细胞膜分化抗原的检测　采用APAAP方法，阳性反应为红色，定位在胞浆和胞膜，计数200个细胞，以阳性细胞＞30%为该抗原表达阳性，否则为阴性^［3］。

　　7　P-gp表达检测　取培养前后的细胞悬液涂片，空气干燥，用SP检测试剂盒检测。光镜下计数500个细胞。每次操作均设置对照组同时进行。胞浆或胞膜着棕黄色者为阳性，阴性细胞不着色，然后计算出阳性细胞百分率。P-gp阳性细胞＞10%为mdr-1基因表达(或P-gp表达)阳性，5%～10%为可疑表达，＜5%为阴性^［4］。

　　8　细胞毒性测定　参照文献MTT方法^［5］并加改进。用酶标仪在540nm波长下测定每孔吸光度(A，曾称光密度OD)值。取8孔A值的平均值，按下式计算药物对细胞的抑制率(%)：

细胞抑制率(%)=(1-(试验孔A平均值)/(对照孔A平均值))×100%

　　9　统计学方法　t检验、χ²检验或直接概率法及相关回归分析。

结　　果

　　1　细胞形态学和细胞化学改变　31例AML细胞经G-CSF作用7天后，形态学观察有15例患者分化成熟细胞比例明显增加，其中M₁1例，M₂3例，M₃4例，M₄3例和M₅4例。结合细胞化学染色，白血病细胞分化方向，除3例分别向粒-单系和单核细胞方向分化外，其余各例均向粒系方向分化。

　　2　NBT还原率和细胞膜分化抗原变化　G-CSF诱导后AML细胞NBT还原率增加，分化与未分化细胞比较也有明显差异(P＜0.01)。并且分化组细胞膜分化抗原CD_11b(67%)和CD₁₅(80%)阳性表达率明显增加，同时代表细胞早期阶段的膜分化抗原CD₁₃和CD₃₃表达率明显下降或转阴。

　　3　P-gp在AML细胞的表达　31例患者中13例(41.94%)具有mdr-1基因表达。不同AML亚型的mdr-1表达阳性率以M₅最高(62.5%)，M₃最低。

　　4　G-CSF对P-gp调节　13例P-gp阳性患者白血病细胞在G-CSF作用下，经细胞形态学、细胞化学、膜分化抗原及NBT还原能力检测分析，有8例分化成熟。有分化的8例中有7例P-gp水平降低，其中4例阴转，1例降为可疑阳性；在未分化的5例中2例下降，其中1例阴转，分化与未分化组P-gp下降比较有显著差异(P＜0.05)。随细胞原发性P-gp表达水平下调，细胞对柔红霉素敏感性也增加(P＜0.001)。在对照组、分化组、未分化组柔红霉素的IC₅₀值分别为22.15±2.89，4.79±4.12，10.94±4.19μg/ml;在分化伴P-gp转阴组和P-gp未转阴组IC₅₀值分别为1.92±1.86和7.66±

　　3.77μg/ml,两者比较，P＜0.05。

讨　　论

　　多药耐药是导致白血病化疗失败的主要原因。研究表明，多药耐药为白血病细胞mdr-1基因过度扩增，致膜上分子量为17万的跨膜糖蛋白(P-gp)过度表达所致。

　　近年发现，在造血组织只有CD₃₄阳性细胞或非成熟细胞表达mdr-1，成熟的粒和单核细胞不表达^［6］。在临床上P-gp表达与CD₃₄明显相关，P-gp似乎与分化差类型白血病或更原始的细胞表型相关，提示该基因很可能随细胞分化表达水平下调。我们的结果显示，G-CSF作用后，随白血病细胞分化，P-gp表达水平确实下调，并且发现，随P-gp下调细胞对柔红霉素敏感性显著增加。本研究结果表明，利用诱导分化剂调节多药耐药基因表达有效。因而，若能开展这方面的深入研究，或许能为克服白血病细胞多药耐药现象开辟新途径。

参 考 文 献

　　1　Colombat PH,Santni V,Delwel R,et al. Primary human acute myeloblastic leukemia:an analysis of in vitro granulocytic maturation following stimulation with retinoic acid and G-CSF.Br J Haematol,1991,79:382-389.

　　2　Collins SJ,Bodner A,Ting R.Induction of morphological and functional differentiation of human promyelocytic leukemia cells (HL60),by compounds which induce differentiation of murine leukemia cells.Inter J Cancer,1980,25:213-218.

　　3　李惠芳，孙桂香，卢薇薇，等.白血病多药耐药基因表达与细胞表面分化抗原的关系.中华血液学杂志，1995，16：75-77.

　　4　杨纯正，栾凤君，刘炳仁，等.白血病多药耐药检测.中华血液学杂志，1992，13：421.

　　5　Carmichael J,Degnaff WG,Gadzer AF,et al .Evaluation a tetrazolium based semiautomated colorimetric assessment of chemosensitivity testing.Cancer res,1987,47:936-942.

　　6　Chaudhary PM,Roninson IB.Expression and activity of P-glycoprotein,a multidrug efflux pump,in human hematopoietic stem cells.Cell,1991,66:85-94.

(收稿:1997-01-07　　修回：1997-07-11)

(校对：张吉贤)