急性白血病患者多药耐药相关蛋白基因表达及临床意义
中华血液学杂志 1998年第2期第19卷 论 著
作者：王福旭 董作仁 罗建民 张学军 郭晓楠 任金海 林凤茹 姚尔固
关键词： 白血病；抗药性，多药；聚合酶链反应；预后；基因表达
摘要 目的：研究急性白血病(AL)多药耐药相关蛋白(MRP)基因表达与临床耐药的关系。方法：应用半定量逆转录-聚合酶链反应，检测了65例AL患者骨髓和15名正常人外周血单个核细胞中MRP基因的表达。以MRP/β2微球蛋白(β2M)评价MRP的表达水平，将MRP/β2M≥0.3表示为MRP阳性。结果：复发难治组MRP的平均表达水平及阳性率最高，与正常对照组、初治组、长期生存组的MRP平均表达水平及阳性率相比均有显著差异(P＜0.05)，而长期生存组与正常对照组之间无统计学差异。初治组MRP阳性病例与MRP阴性病例的首次完全缓解率(分别为25%和84%)之间有显著差异。MRP表达水平在FAB各亚型间略有差异。同时检测了65例AL患者mdr-1基因的表达，发现临床耐药组MRP和mdr-1的平均表达水平及阳性率均明显高于临床非耐药组，MRP和mdr-1基因的表达水平之间无相关性(rs=0.1683)。结论：MRP基因过度表达可导致临床耐药，是预后的重要不利因素。
The clinical significance of multidrug resistance associated protein(MRP) gene expression in acute leukemia Wang Fuxu,Dong Zuoren,Luo Jianmin,et al.Second Affiliated Hospital,Hebei Medical
University,Shijiazhuang 050000
Abstract Objective:To investigate the relationship between the expression of the multidrug resistance-associated protein(MRP) gene and clinical drug resistance in acute leukemia(AL).Methods:Semi-quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction was used to examine the expression of MRP gene in 65 bone marrow aspirates of AL patients and 15 normal volunteer's peripheral blood mononuclear cells.The expression level of MRP were expressed as ratio of MRP/β2M(β2-microglobulin) and the ratio of MRP/β2M≥0.3 was defined as MRP positive.Results:The level of MRP mRNA and the positive percentage of MRP in relapsed-refractory group were significantly higher than that in normal control group.In newly diagnosed group,the first complete remission rate of MRP negative patients(84%) was significantly higher than that of MRP positive(25%) patients.MRP expression level was different in leukemia sub-type.MRP and mdr-1 genes were examined simultaneously in 65 AL patients,the mean expression level and positive percentage of MRP and mdr-1 in clinical resistance group were significantly higher than those in non-resistance group.No significant correlation was found between the MRP and mdr-1 expression(rS=0.1683).Conclusion:High expression of MRP leads to drug resistance and it is an unfavorable factor to prognosis.
Key words Leukemia Drug resistance,multiple Polymerase chain reaction Prognosis Gene expression
最近，在非P糖蛋白(P-gp)介导的肿瘤耐药细胞系中，发现多药耐药相关蛋白(MRP)基因过度表达［1］。细胞系研究证明，将含有MRP的cDNA通过载体转染到药物敏感细胞，可使转染细胞获得多药耐药性［2］，说明MRP基因过度表达确与多药耐药有关，但临床研究报道不多，且结果不一［3］。我们检测了65例急性白血病(AL)标本，分析了MRP基因的表达水平与临床耐药及FAB分型的相关性，观察了初治患者MRP表达水平的预后意义以及MRP与mdr-1基因表达水平的相关性。
材料和方法
1 研究对象 AL患者65例，为1995年10月～1996年8月我院门诊随访及住院患者。初治组33例，复发难治组18例，长期生存组14例(完全缓解5～14年)。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)12例(L1 4例，L2 8例)，急性非淋巴细胞白血病(ANLL)53例(M1 1例，M2 7例，M3 23例，M4 5例，M5 12例，M6 2例，混合型3例)。男性35例，女性30例，中位年龄35岁(16～72岁)。15名健康志愿者作为正常对照。患者标本取自骨髓，对照标本取自外周血。
初治ALL患者采用VCDP(长春新碱、环磷酰胺、柔红霉素、泼尼松)方案诱导缓解；ANLL患者采用DA(柔红霉素、阿糖胞苷)或HD(三尖杉酯碱、柔红霉素)方案，其中M3患者采用全反式维甲酸(ATRA)或以ATRA为主联用小剂量DA或HA方案化疗。复发难治患者采用Vm26 A(威猛、阿糖胞苷)和Vm26 Am(威猛、安吖啶)方案。
2 细胞分离及总RNA的提取 取静脉血5ml或骨髓2ml，用1ml肝素(107U/L)抗凝，再用生理盐水稀释3～4倍，Ficoll淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)4ml，2000r/min离心16分钟，分离出单个核细胞，用生理盐水洗涤3次，-80℃保存或直接提取RNA。用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法［4］提取细胞总RNA，溶于15μl 去离子水中，紫外分光光度计定量，并要求吸光度(曾称光密度OD)A260∶A280≥1.8，0.8 %琼脂糖凝胶电泳，显示两条清晰的28s和18s带，表明提取的RNA结构完整。
3 聚合酶链反应引物 MRP引物设计参考文献［5］，mdr-1及β2微球蛋白(β2M)引物设计参考文献［6］。
MRP正义引物5′GGACCTGGACTTCGTTCTCA 3′
MRP反义引物5′CGTCCAGACTTCTTCATCCG 3′
mdr-1正义引物5′CCCATCATTGCAATAGCAGG 3′
mdr-1反义引物5′GTTCAAACTTCTGCTCCTCA 3′
β2M正义引物5′ACCCCCACTGAAAAAGATGA 3′
β2M反义引物5′ATCTTCAAACCTCCATGATG 3′
在DNA合成仪(美国Applied Biosystems公司)上合成。MRP扩增片段长度为292bp，mdr-1扩增片段长度为157bp，β2M扩增片段长度为115bp。
4 半定量逆转录-聚合酶链反应
4.1 cDNA的合成：逆转录反应体系20μl，包括细胞总RNA 1μg，RNasin 20U，5×逆转录反应缓冲液4μl(Tris-HCl 10mmol/L， pH8.3；KCl 50mmol/L；MgCl2 5mmol/L)，1mmol/L dNTP，100ng随机引物，AMV反转录酶(Promega)25U。 25℃ 10分钟，42℃反应30分钟，99℃5分钟终止反应。
4.2 PCR反应：反应体系50μl，包括逆转录产物10μl，寡核苷酸引物各50pmol，dNTP 200μmol/L，10×PCR缓冲液5μl(Tris-HCl 10mmol/L,pH8.4；MgCl2 1.5mmol/L；BAS 20μg/ml；KCl 50mmol/L)，TaqDNA聚合酶(Promega)1.5U。94℃40秒，55℃40秒，72℃60秒，在PCR扩增仪(美国PE公司)上扩增30个循环。
4.3 PCR产物定量分析：取10μl扩增产物，2%琼脂糖凝胶电泳，75V，50分钟，EB染色，紫外灯下观察结果并照相，在岛津CS-930型双波长色谱扫描仪上扫描电泳带，计算MRP/β2M的比值，作为MRP的相对表达水平。
5 统计学处理 结果用SAS(6.03)统计软件处理。采用秩和检验，χ2检验，确切概率法检验。
结 果
1 AL患者及正常人MRP基因的表达 根据正常人及各病例组MRP的表达水平与临床耐药的相关性，将MRP/β2M≥0.3定为MRP阳性。正常对照组MRP的表达水平最低(0.0564)，长期生存组MRP表达(0.1012)为正常对照组的1.9倍，但在统计学上无差异(P=0.5230)，初治组MRP表达水平为0.2883，明显高于正常对照组(P=0.0347)。复发难治组表达水平最高(0.8615)，是正常对照组的9.3倍(P=0.0006)，与长期生存组和初治组也有显著性差异。MRP的阳性表达率，正常对照组(13.33%)、长期生存组(15.38%)和初治组(24.24%)较低，三者之间无统计学差异；复发难治组较高(61.11%)，与前三组相比，均有显著性差异，结果见表1。
2 MRP基因表达对预后的影响 初治组MRP阳性与MRP阴性患者的首次完全缓解(CR)率分别为25%(8例中2例)和84%(25例中21例)，具有显著差异(P=0.004)。复发难治组MRP阳性与MRP阴性患者的再CR率分别为18.2%(11例中2例)和28.6%(7例中2例)，无显著差异(P=0.377)。
3 MRP表达与FAB分型的关系 ALL组MRP的平均表达水平及阳性率略高于ANLL组，但无统计学差异。 在ANLL各亚型间，M3的MRP平均表达水平及阳性率最低，分别为0.0855和13.04%，而M5的表达水平及阳性率较高，分别为0.6183和41.68%，有统计学差异，但与其它亚型间无显著差异，结果见表2。
4 MRP与mdr-1基因表达的相关性 对65例AL患者(临床耐药组28例，临床非耐药组37例)同时检测了MRP和mdr-1 基因的表达。 临床耐药组MRP和mdr-1 的平均表达水平(0.8218，0.6506) 明显高于临床非耐药组(0.1122，0.0714)，分别为6.5和5.6倍，具有显著性差异(P＜0.01)。临床耐药组MRP和mdr-1的阳性率(64.28%，57.14%)明显高于临床非耐药组(10.18%，8.10%)，均具有显著性差异(P＜0.05)。另外，11例mdr-1阴性的临床耐药患者中，8例MRP阳性，即有MRP的过度表达；10例MRP阴性的临床耐药病例中，7例为mdr-1阳性，即有mdr-1的过度表达。65例AL患者mdr-1和MRP的表达水平之间无相关性，rs=0.1683(P＞0.2)。结果见表3。
讨 论
本研究结果显示，临床耐药组MRP基因的平均表达水平及阳性率均明显高于临床非耐药组，说明临床耐药与MRP表达水平相关，MRP基因过度表达是导致临床耐药的重要机制。杨仁池等［7］观察了32例AL患者MRP的表达，发现临床耐药组阳性率(66.67%)明显高于CR组(20%)(P=0.0213)，与我们的结果一致。复发难治AL患者MRP基因的表达水平及阳性率明显高于初治组、对照组及长期生存组，提示MRP基因表达水平的增高有预后意义。
表1 各组MRP表达水平及阳性率的比较
| 组别 |
例数 |
MRP/β2M |
MRP＋ |
| 中位数(范围) |
P值 |
例数(%) |
P值 |
| 正常对照组 |
15 |
0(0～0.328) |
|
2(13.33) |
| 长期生存组 |
14 |
0(0～0.571) |
0.5230＃ |
2(14.29) |
1.0 |
| 初治组 |
33 |
0.036(0～2.688) |
0.0347# |
8(24.24) |
0.7689 |
| 复发难治组 |
18 |
0.549(0～3.834) |
0.0006# |
11(61.11) |
0.0109 |
#与正常对照组相比(秩和检验)；与正常对照组相比(确切概率法检验)
表2 FAB分型后各组MRP表达水平及阳性率的比较
| 组别 |
例数 |
MRP/β2M |
MRP＋ |
| 中位数(范围) |
P值 |
例数(%) |
P值 |
| ALL |
12 |
0.351(0～1.717) |
0.079 |
6(50.00) |
＞0.1＃ |
| ANLL |
53 |
0.067(0～3.834) |
|
12(24.48) |
| M2 |
7 |
0(0～0.384) |
0.289△ |
2(28.57) |
＞0.05▲ |
| M3 |
23 |
0(0～0.571) |
|
3(13.04) |
| M4 |
5 |
0(0～0.382) |
0.779△ |
2(40.00) |
＞0.05▲ |
| M5 |
12 |
0(0～2.688) |
0.016△ |
5(41.67) |
＞0.05▲ |
与ANLL组相比；△与M3相比(秩和检验)。＃与ANLL组相比；▲与M3相比(确切概率法检验)
表3 各组MRP表达水平及阳性率的比较
| 组别 |
例数 |
MRP/β2M |
mdr-1/β2M |
| 中位数(范围) |
P值 |
中位数(范围) |
P值 |
| 正常对照组 |
15 |
0(0～0.328) |
|
0(0～0.328) |
| 临床非耐药组 |
37 |
0(0～0.956) |
0.2109# |
0(0～0.501) |
0.352* |
| 临床耐药组 |
28 |
0.538(0～3.834) |
0.0003## |
0.388(0～2.487) |
＜0.001** |
#与正常对照组相比; ##与临床非耐药组相比(秩和检验)。与正常对照组相比; 与临床非耐药组相比(确切概率法检验)Schneider等［8］检测了17例AL患者，发现复发时MRP基因表达是初治时的2倍(P＜0.01)，与我们的结果一致。长期生存组病例的平均表达水平及阳性率均接近于正常对照组水平，14例患者完全缓解5～14年(结止至1996年3月)，其中12例未检测到MRP基因表达，2例表达水平较低，分别为0.384和0.571，连续随访，MRP表达水平无变化，也均未发现复发迹象，此内容未见到相关报道。
初治病例中，MRP阳性患者的首次完全缓解率明显低于MRP阴性患者，说明MRP的表达水平对AL患者的预后有显著影响，同时也说明MRP基因的过度表达并不完全依赖于化疗药物的长期诱导，可能与肿瘤细胞的遗传异质性有关。复发难治组MRP阳性患者的再CR率与MRP阴性患者没有差别，推测与临床耐药因素的多样性有关。
ALL患者MRP的平均表达水平及阳性率高于ANLL患者，但无统计学差异，Hart等［9］亦发现同样的结果。在ANLL各亚型间，M3患者的平均表达水平及阳性率明显低于M5患者，而在其它亚型间，差异不明显。杨仁池等［7］亦发现M3亚型MRP的平均表达水平及阳性率最低，M2最高，但无统计学差异。根据以上结果和资料分析，各型AL患者，由于白血病细胞处于不同的分化阶段，MRP基因的表达水平可能有一定差异，因病例数少，不能将其显示出来。
65例AL患者MRP和mdr-1的表达关系分析发现，MRP与mdr-1的表达之间不存在相关性，与Schneider等［8］的结果一致。说明在临床耐药病例中，MRP与mdr-1可同时过度表达，也可以单独过度表达。由于耐药机制的多样性，同时检测两种耐药机制，可以更准确的判断临床耐药。
本实验采用了RT-PCR方法，它具有特异、灵敏、重复性强的特点。实验中用β2M作为内对照，并用MRP/β2M的比值作为评价MRP的相对表达水平的指标，消除了许多实验因素对MRP定量的影响，使患者的MRP表达水平得到了真实的反映。由于不同的扩增条件对扩增结果影响很大，单纯地把出现紫外灯下视力可见的扩增带作为MRP阳性的标准，必然使不同作者的实验结果产生很大出入。因此，我们根据各组实验的结果，将MRP/β2M≥0.3定为MRP阳性。此标准判别临床耐药的准确性最高，为78.5%。应用统一反应条件，进行更多病例的观察，可使阳性标准更加完善。
参 考 文 献
1 Cole SPC,Bhardwaj G,Gerlach JH,et al.Overexpression of a transporter gene in multidrug-resistant human lung cancer cell line.Science,1992,258:1650-1654.
2 Kruh GD,Chan A,Myers K,et al.Expression complementary DNA library transfer establishes mrp as a multidrug resistance gene.Cancer Res,1994,54:1649-1652.
3 王福旭，董作仁，姚尔固.肿瘤及白血病细胞多药耐药相关蛋白基因的研究与进展.国外医学输血及血液学分册，1996，19:135-137.
4 Chomczynski P，Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acidguanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extration. Anal Biochem，1987，162:156-160.
5 Abbaszadegan MR，Futscher BW，Klimechi WT，et al.Analysis of multidrug resistance-associated protein(MRP) messenger RNA in normal and malignant hematopoietic cells.Cancer Res，1994，54:4676-4679.
6 Noonan KE，Beck C，Holzmayer TA，et al.Quantitative analysis of MDR1(multidrug resistance) gene expression in human tumors by polymerase chain reaction.Proc Natl Acid Sci USA，1990，87:7160-7163.
7 杨仁池,杨纯正,郝玉书，等.急性白血病多药耐药相关蛋白基因表达及其与免疫表型和FAB分型的关系.中华血液学杂志,1996,17:339-341.
8 Schneider B，Cowan KH，Bader H，et al.Increased expression of the multidrug resistance-associated protein gene in relapsed acuted leukemia.Blood，1995，85:186-193.
9 Hart SM,Ganeshaguru K,Hoffbrand AV, et al. Expression of the multidrug resistance-associated protein(MRP) in acute leukemia.Leukemia,1994,8:2163-2168.
(收稿：1996-12-09 修回：1997-07-16)
(校对：王汝瑞)
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