亲溶酶体药物IHW2净化骨髓在白血病患者自体骨髓移植中的应用

中华血液学杂志 1998年第6期第19卷 论　　著

作者：姜容　韩明哲　赵英新　邱录贵　徐国珠　冯四洲　韩俊领　严文伟　郝玉书

　　关键词： 骨髓移植，自体；骨髓净化，IHW2；白血病

　　摘要　目的:观察亲溶酶体药物IHW2体外净化急性髓细胞白血病骨髓(BM)进行骨髓移植(ABMT)的临床疗效。方法: 用IHW2体外净化ABMT患者的BM,冷冻保存后回输给患者。结果: 3例患者输用净化处理的BM后均成功地恢复造血功能。2例患者移植后至今已分别持续缓解超过36、34个月。其中1例患者移植前染色体为46XY,del(16)(q22),移植后2个月检测为46XY正常染色体核型。1例患者于移植后19个月复发。结论:初步研究显示亲溶酶体药物IHW2,用于临床移植患者是安全可行的，并且对白血病骨髓有一定的净化作用。

　　Application of IHW2 purged bone marrow to autologous bone marrow transplantation in the treatment of acute myeloid leukemia　Jiang Rong, Han Mingzhe, Zhao Yingxin, et al. Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, CAMS and PUMC, Tianjin　300020

　　Abstract　Objective: To observe the clinical effectiveness of IHW2 purged autologous bone marrow transplantation (ABMT) in the treatment of AML patients.Methods: Large volume of bone marrow was purged in vitro by IHW2 and then reinfused to patients for ABMT.Results: All of the three patients transplanted with IHW2 purged autologous bone marrow successfully reconstituted hemopoiesis. Two patients got continuous complete remission for 36⁺ and 34⁺ months, respectively. The karyotype of one of the two patient was 46,XY,del(16)(q22) before ABMT and changed to 46,XY in 2 months after transplantation. The third patient relapsed after ABMT 19 months.Conclusion: The preliminary study suggests that IHW2 may have certain purging effect on leukemic cells and is safe for clinical application.

　　Key words　Bone marrow transplantation, autologous　　Bone marrow purging, IHW₂　　Leukemia

　　急性白血病缓解期骨髓中仍含有一定数量的白血病细胞,移植后可能导致复发。这也是ABMT复发率高于异基因骨髓移植(allo-BMT)的原因之一。因此体外净化一直是学者们关注的热点^［1］。近年来我们研究了亲溶酶体药物IHW2对于急性髓细胞白血病(AML)细胞及正常造血干细胞的杀伤作用,实验证明药物IHW2能有效地杀灭AML祖细胞CFU-L,而对正常造血祖细胞CFU-GM影响较少^［2］。在此实验基础上，我们用IHW2对3例AML　ABMT患者的BM进行了大规模的净化处理,用净化后BM进行ABMT。

病例和方法

　　1　病例　3例AML患者均为男性，年龄分别为34，23及33岁，均处于缓解期,于1994年在我院接受自体骨髓移植治疗，移植时缓解时间分别为8，4，6个月，3例AML分别为M_4EO、M₆、M₁。

　　2　预处理方案　3例患者均采用TBI 9Gy, -4天; Cy 60mg*kg^－1*d^－1, -3，-2天;Ara-C 1g*m^－2*d^－1, -3，-2天方案。

　　3　骨髓采集、分离、净化、冷冻保存及培养

　　3.1　骨髓采集：患者在硬膜外麻醉后,经髂骨多部位穿刺采集骨髓。采集的骨髓用肝素40U/ml抗凝,过滤后计数有核细胞数。

　　3.2　单个核细胞分离：将采集的骨髓每100ml置于预先装有80ml淋巴细胞分离液的无菌空血袋的液面上,在4℃大容量离心机中以1500r/min的速度离心18分钟,弃上清,收集单个核细胞(MNC)层,将所收集的MNC汇集后用TC199细胞培养液洗涤两次,其1/3,约相当于1×10⁸／kg个有核细胞的量直接冷冻保存用作保底。另外2/3，即相当于2×10⁸／kg个有核细胞的量用于净化处理。

　　3.3　药物来源：IHW2是我所药物室研制合成的十二烷基吗啉的衍生物,为无色透明水溶性药物。

　　3.4　净化方法：将用于净化的MNC盛入无菌塑料空袋中,用含10%人AB血清的TC199液稀释成1×10⁷/ml的细胞浓度,然后加入IHW2,IHW2的浓度为20μg/ml。将血袋放入37℃水浴中孵育30分钟,每10分钟摇动混匀1次,孵育结束后再将袋子放入冰水5分钟终止药物反应。取出袋子,加入TC199液洗涤两次,再用TC199液将细胞稀释至100ml左右，使细胞浓度不超过5×10⁷／ml。冷冻前取细胞做细胞计数、台盼蓝拒染率和CFU-GM、CFU-L测定。

　　3.5　冷冻保存及回输：将保底及净化后的MNC分别盛于低温冷冻袋(上海产)中,再与配制好的预冷于4℃的防冻液按1∶1比例缓慢混匀(防冻液的成分为: 20% DMSO; 10% AB血清; 70% TC199),放入Cryo Med程控降温机中按1℃/min的速度降温到-40℃,再以10℃/min的速度降温到-80℃。取出装有净化后骨髓的袋子投入到液氮中保存。回输时将骨髓放入42℃水浴中在1分钟中内快速融化,立即全速回输。并留样品做细胞计数及CFU-GM测定。

　　3.6　细胞培养:CFU-GM、CFU-L培养同文献［2］。

结果

　　1　骨髓经淋巴细胞分离液分离后得到的MNC占全骨髓有核细胞的0.30, 其中成熟粒细胞的比例0.10。

　　2　骨髓经IHW2净化后细胞数的回收率为82.4%～98.3% ,CFU-GM的回收率为66.6%～86.2%,冷冻保存后回输给患者的细胞数为(0.45～0.54)×10⁸/kg,回输的CFU-GM总数为(1.13～3.44)×10⁴/kg。3例患者均未输用保底的骨髓。

　　3　为检测骨髓中残存的克隆性白血病细胞,在3例患者净化前后分别做了CFU-L培养,结果均未测到CFU-L集落。3例患者在移植前后均做了染色体检测,1例患者在移植前为46 XY,del(16)(q22),移植后两个月检测为46 XY,正常核型。另两例患者在移植前未测到可供分析的中期分裂相。移植后4个月检测均为46 XY,正常染色体核型。

　　4　3例患者预处理后6天白细胞计数均降为零,骨髓回输后白细胞恢复至＞0.5×10⁹／L的时间分别为16，32和15天，恢复至＞1.0×10⁹／L的时间分别为18，39，19天，移植后CR时间2例分别为超过36，34个月及1例为19(复发)个月，均成功地重建了造血功能。

讨论

　　ABMT作为治疗AML的方法已广泛地用于临床,但移植物中残存的白血病细胞严重影响了其疗效^［3］。最近Brenner等^［4］用分子生物学的方法证明残存于骨髓中的肿瘤细胞导致或有助于ABMT后的复发。这一发现更加说明了在ABMT中骨髓净化和细胞阳性选择移植的重要性。目前净化的方法有多种,其中药物净化如4 HC、ASTA-Z用于AML移植患者骨髓的净化已取得了一定的效果。经净化的骨髓移植后复发率为21%～38%,长期无病生存率为61%～76%;未经净化的骨髓移植后复发率为49%～67%,长期无病生存率为26%～44%^［5］。其它净化方法如免疫单克隆抗体净化、细胞因子净化等也有了广泛的应用。

　　亲溶酶体药物用于体外净化AML细胞也有报道,如十二烷基吗啉(NDM)在体外能特异性地杀灭富含溶酶体的白血病细胞^［6］,联合42℃加温效果更佳^［7］。但由于NDM需用乙醇配制, 实验室中发现乙醇对正常细胞有明显的非特异性杀伤作用。为此我们选用了NDM的衍生物IHW2, IHW2是一种水溶性亲溶酶体药物,在分子中加入了亲水基团使之易于进入细胞,此药在细胞内的溶酶体内聚集,达到一定的限度导致溶酶体破裂,释放水解酶使细胞破裂死亡^［8］。在急性髓细胞白血病细胞中含有大量的溶酶体而且细胞的吞饮作用比正常细胞快,而正常造血干细胞不含有溶酶体,或溶酶体功能不健全，因此亲溶酶体药物能选择性地杀灭白血病细胞。我们用IHW2做了一系列体外净化实验,研究证明IHW2能选择性杀灭白血病细胞。在此基础上我们选用了既对白血病细胞有一定杀伤作用,又不明显损伤正常造血祖细胞的IHW2剂量,对3例AML患者的骨髓在体外进行了大规模的净化处理,净化后CFU-GM的回收率为66.6%～86.2%,净化后的骨髓经冷冻保存后回输给患者均重建了造血功能,造血恢复期未见延长,说明此剂量IHW2用于临床是安全的。1例患者在移植前染色体为46XY,del(16)(q22)，移植后2个月测为正常46XY,可能与IHW2的体外净化有关。两例患者在移植后至今已分别持续缓解超过36及34个月,另1例在持续缓解19个月后复发。总之,我们初步的研究结果表明，IHW2体外净化骨髓用于ABMT患者是安全可行的,而且对AML细胞有一定的净化效果。

参 考 文 献

　　1　Gorin NC,Labopin M, Meloni G, et al. Autologous bone marrow transplantation in acute myeloblastic leukemia in Europe: futher evidence of the role of marrow purging by mafosfamide.Leukemia, 1991, 5:896-904.

　　2　徐国珠, 姜容, 王军，等. 亲溶酶体药物IHW2和IHW3 对急性髓细胞白血病细胞体外净化的研究. 中华血液学杂志， 1994, 5:233-235.

　　3　Miiller CB, Rowlings PA, Jone RJ， et al. Autotransplants for acute myelogenous leukemia (AML):effect of purging with 4-hyeroperoxyclophosphamide(4HC). Blood， 1995，86:100a (Abstr).

　　4　Brenner MK, Rill DK, Moen RC， et al. Gene-marking to trace origin of relapse after autologous bone marrow transplantation. Lancet， 1993， 341:85-86.

　　5　Damon LE, Rugo HS, Ries CA，et al. Delayed engraftment of 4-hydroperoxycyclopnospjamide-purged autologous bone marrow after induction treatment containing mitoxantrone for acute myelogenous leukemia.Bone Marrow Transplant，1996，17:93-99.

　　6　Douay L, Gorin NC, Gerota I, et al. In vitro treatment of leukemic bone marrow for autologous transplantation. Exp Haematol, 1982, 10(Suppl 12): 113.

　　7　刘力民, 严文伟, 郝玉书，等. 十二烷基吗啉联合加温对急性髓细胞白血病祖细胞的作用. 中华血液学杂志, 1988, 9: 524-526.

　　8　王军, 杨纯正, 马建国. 新亲溶酶体剂IHW2净化小鼠白血病的实验研究. 中华血液学杂志， 1991, 12:295-297

(收稿：1997-04-21　　修回：1997-10-17)

(校对：董文革)