细胞因子对白血病细胞B7-1基因表达及诱导外周血T细胞活化的影响
中华血液学杂志 1998年第6期第19卷 论 著
作者：黄贵清 李成荣 杨锡强
关键词： B7-1；白血病细胞；细胞因子
摘要 目的：观察γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-10、IL-12对转染B7-1白血病细胞B7-1基因表达及其诱导健康人外周血单个核细胞（PBMC）产生IFN-γ、IL-2的影响。方法：用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和酶联免疫吸附反应(ELISA)方法检测IFN-γ、IL-2基因表达和蛋白质合成。结果：发现IFN-γ、IL-12增强PBMC产生IL-2、IFN-γ，IL-10抑制其产生，同时发现IFN-γ、 IL-12增强转染B7-1白血病细胞B7-1基因表达，IL-10抑制其表达。结论：细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-12影响转染B7-1白血病细胞诱导PBMC产生IFN-γ、IL-2，其可能是通过影响B7-1基因表达实现的。
The effect of cytokines on the activation of T cells induced by B7-1-transfected leukemia cells Huang Guiqing, Li Chengrong, Yang Xiqiang. Children's Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400014
Abstract Objective: To observe the effects of IL-12, IFN-γ, IL-10 on the B7-1 expression of B7-1 transfected leukemia cells (K562 and HL-60) and on the IL-2 and IFN-γ expression and production in the peripheral blood mononuclear cells(PBMC) induced by B7-1 transfected K562 and HL-60 cells．Methods: RT-PCR and ELISA techniques were used to assay the expression and production of IFN-γ and IL-2.Results: IFN-γ and IL-12 increased the expressions of B7-1, IL-2 and IFN-γ, but IL-10 inhibited all the expressions.Conclusion: IFN-γ,IL-10 and IL-12 affected the expression and production of IFN-γ and IL-2 possibly by affecting the B7-1 expression.
Key words B7-1 Leukemic cell Cytokine
我们曾报道转染人B7-1基因的白血病细胞可增强 T淋巴细胞增殖及细胞毒性 T淋巴细胞(CTL)反应，并证实 B7-1白血病细胞诱导外周血单个核细胞(PBMC)产生白细胞介素(IL)-2和γ干扰素(IFN-γ)。为探讨肿瘤免疫反应中细胞因子对B7-1白血病细胞诱导PBMC产生淋巴因子有无协同作用，我们观察了IFN-γ、IL-10、IL-12对B7-1+白血病细胞B7-1基因表达的影响，并对上述细胞因子对肿瘤细胞诱导PBMC产生IL-2、IFN-γ的影响进行了进一步研究。
材料和方法
1 试剂及细胞株 白血病细胞株K562和HL-60由重庆医科大学病理生理教研室汤为学教授赠送。包装细胞PA317由第三军医大学分子生物学教研室刘昕博士赠送，丝裂霉素C、重组IFN-γ、IL-10、IL-12购自美国Promega公司, IL-2、IFN-γ ELISA试剂药盒购自美国Kingsun公司，IL-2、IFN-γ、β-actin引物由上海细胞生物研究所合成。
2 刺激细胞的准备 磷酸钙沉淀法［1］转染重组体PLB7-1SN(本室制备)于包装细胞PA317，获高滴度B7-1病毒上清，用其感染白血病细胞株K562和HL-60，获表达B7-1基因的肿瘤细胞克隆。
3 IFN-γ、IL-10、IL-12影响B7-1表达 置2×106个/孔(1ml)B7-1+ K562、B7-1+HL-60于24孔板中，分别于每孔加100U/ml IFN-γ，10ng/ml IL-10，20ng/ml IL-12，混匀后培养12小时，收集细胞，提取总 RNA，RT-PCR扩增B7-1基因,引物合成及反应程序参照文献［2］,同时以β-actin作为RNA内部质控。
4 诱导IL-2及IFN-γ合成 常规分离健康人外周血PBMC，24孔板中加入PBMC 1×106个/孔，分别加入丝裂霉素C处理(40μg/1×106个，37℃，1小时)的刺激细胞B7-1+ K562、neo-K562(转染空载体的K562)、野生型K562、B7-1+ HL-60、neo-HL-60、野生型HL-60 1×105个/孔，分别于每孔加100U/ml IFN-γ、10ng/ml IL-10、20ng/ml IL-12,37℃，5% CO2孵育24小时。
5 IL-2、IFN-γ的检测
5.1 IL-2、IFN-γ mRNA水平检测：收集混合培养细胞，提取总RNA，RT-PCR检测IL-2、IFN-γ基因表达，IFN-γ、IL-2引物合成及PCR反应程序参照文献［3］，同时以β-actin作为RNA内部质控。
5.2 IL-2、IFN-γ蛋白质测定：收集混合细胞培养上清，按IL-2、IFN-γ ELISA试剂药盒说明书操作，记录单位为pg/ml。
结果
1 细胞因子对转染B7-1白血病细胞B7-1基因表达的影响 由RT-PCR检测结果可见，IFN-γ、IL-12增加B7-1+ K562、B7-1+ HL-60细胞B7-1 mRNA表达，IL-10则使B7-1基因表达减弱，图1为3次重复实验结果。
1:ΦX174标记；2：加IFN-γ；3：加IL-12；4：加IL-10；5：对照
图1 细胞因子对转染B7-1白血病细胞B7-1基因
表达的影响
2 转染B7-1白血病细胞诱导IL-2和IFN-γ mRNA表达及蛋白质合成 B7-1＋ K562、B7-1＋ HL-60诱导PBMC表达IL-2、IFN-γ mRNA,而B7-1－ K562、B7-1－ HL-60无细胞因子基因转录信号测及，进一步用ELISA检测，从蛋白水平证实B7-1＋白血病细胞诱导的IL-2、IFN-γ较B7-1－白血病细胞组明显增加。
3 细胞因子对B7-1＋白血病细胞诱导PBMC产生IL-2和IFN-γ的影响 当培养孔中加入适宜浓度的IFN-γ、IL-10、IL-12，观察其是否影响PBMC合成IL-2和IFN-γ，结果发现IFN-γ和IL-12增加IL-2、IFN-γ mRNA表达及蛋白质合成，IL-10抑制其表达(图2～5)。
1：加IFN-γ；2：加IL-12；3：加IL-10；4：对照(1～4为B7-1＋K562细胞)；5：ΦX174标记；6：加IFN-γ；7：加IL-12；8：加IL-10；9：对照(6～9为B7-1＋HL-60细胞)
图2 细胞因子影响B7-1＋白血病细胞诱导PBMC
IL-2 mRNA表达
1：加IFN-γ；2：加IL-12；3：加IL-10；4：对照(1～4为B7-1＋K562细胞)；5：ΦX174标记；6：加IFN-γ；7：加IL-12；8：加IL-10；9：对照(6～9为B7-1＋HL-60细胞)
图3 细胞因子影响B7-1＋白血病细胞诱导PBMC
IFN-γ mRNA表达
图4 细胞因子影响B7-1＋白血病细胞诱导PBMC
IL-2蛋白质产生
图5 细胞因子影响B7-1＋白血病细胞诱导PBMC
IFN-γ蛋白质产生
讨论
B7-1分子是T细胞增殖活化的第二信号，在肿瘤免疫反应中起重要作用，我们发现转染B7-1的HL-60和K562细胞能诱导T细胞分泌IL-2和IFN-γ，B7-1阴性白血病细胞无此诱导作用。IL-2和IFN-γ是TH1类细胞因子，参与细胞免疫反应，对于抗病毒等细胞内寄生物感染、肿瘤免疫反应具有极其重要的作用［4］。影响丝裂原诱导正常T细胞产生TH1细胞因子的报道较多［5，6］，但肿瘤细胞特别是转染B7-1基因的白血病细胞诱导IL-2和IFN-γ的影响因素并不多见。我们发现IFN-γ、IL-12能增强B7-1＋ K562、B7-1＋ HL-60细胞诱导IL-2、IFN-γ产生，IL-10抑制IL-2和IFN-γ合成，进一步研究IFN-γ、IL-12和IL-10对转染至白血病细胞中的B7-1基因表达的影响，发现IFN-γ、IL-12增加其表达，IL-10抑制其表达，表明在B7-1介导的抗肿瘤免疫反应中，细胞因子可能通过调节B7-1分子的生物学活性影响其对T细胞的活化，转染B7-1基因的白血病细胞促进IL-2、IFN-γ的产生，IL-2生成增加有助于CD8＋ CTL的活化和扩增［7，8］及IFN-γ产生，IFN-γ又能增强MHC Ⅰ、Ⅱ类抗原和粘附分子的表达［9，10］，这能进一步促进T细胞的活化。因此，我们就从TH1类淋巴因子和B7-1基因表达两个方面证实IL-12等细胞因子影响B7-1分子的抗肿瘤免疫反应。目前同时转染B7-1基因和其它细胞因子基因治疗肿瘤的研究更为引人注目［11，12］，因此了解细胞因子对转染B7-1基因的肿瘤细胞B7-1基因表达及其诱导淋巴因子产生的影响具有临床实际应用意义。
参 考 文 献
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(收稿：1997-09-15 修回：1998-02-24)
(校对：王叶青)
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