氧化砷诱导维甲酸耐药早幼粒细胞白血病细胞(MR-2)凋亡的体外研究

中华血液学杂志 1998年第7期第19卷 论　　著

作者：蔡循　贾培敏　石学耕　史桂英　朱新华　王龙　陈赛娟　王振义　陈竺　陈国强

单位：200025　上海第二医科大学附属瑞金医院、上海血液学研究所（蔡循、贾培敏、朱新华、王龙、陈赛娟、王振义、陈竺、陈国强）；上海第二医科大学生物物理教研室（石学耕、史桂英）

　　关键词： 氧化砷；维生素A酸类；白血病，早幼粒细胞性，急性；细胞凋亡

　　摘要　目的：深入了解氧化砷(As₂O₃)治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)的机制。方法：以对全反式维甲酸耐药的APL细胞株MR-2为模型，用细胞生长、活力测定、形态学观察和流式细胞仪分析、四氮唑蓝还原反应及免疫荧光等指标观察As₂O₃治疗APL的效应途径。结果：1.0μmol/L As₂O₃可诱导MR-2细胞凋亡,并能降解APL特异蛋白PML-RARα融合蛋白。结论：As₂O₃治疗APL的效应途径可能不同于ATRA,但PML-RARα可能是二者的共同作用靶点。

　　In vitro study on arsenic trioxide-induced apoptosis of retinoic acid resistant acute promyelocytic leukemia cell line(MR-2)　Cai Xun^*, Jia Peimin, Shi Xuegeng, et al.^*Shanghai Institute of Hematology,Ruijin Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai　200025

　　Abstract　Objective:To study the possible mechanisms of arsenic trioxide (As₂O₃)in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL). Methods:Retinoic acid resistant APL cell line MR-2 was used as in vitro model. The effect of As₂O₃ on MR-2 cell line was observed by cell viability,cell growth,cell morphology,flow cytometry assay,NBT reduction test and immunofluorescence analysis. Results:1.0μmol/L of As₂O₃ could induce apoptosis of MR-2 cells and it correlated with the degradation of PML-RARα fusion protein. Conclusions: The therapeutic effect of As₂O₃ for APL possibly differs from that of ATRA, however, PML-RARα fusion protein may be the target of both the therapy.

　　Key words　Arsenic trioxide　　Retinoid　　Leukemia,promyelocytic,acute　　Apoptosis

　　全反式维甲酸(ATRA)作为诱导分化剂可使大多数急性早幼粒细胞白血病(APL)患者取得完全缓解，但它有两大缺陷：维甲酸耐药及维甲酸综合征。由于维甲酸耐药的发生，大多数APL患者在完全缓解后短期内复发。因此，寻找对维甲酸耐药的APL患者的治疗方法有重要意义。近来，孙鸿德^［1］，张鹏^［2］等报道氧化砷(As₂O₃)10mg/d静脉滴注可有效治疗APL,且毒副作用较少。我所与哈尔滨医科大学合作，应用As₂O₃治疗APL复发患者取得满意疗效^［3］。我们研究发现As₂O₃具有剂量依赖性双重效应，即诱导APL细胞凋亡和部分分化^［4，5］。为进一步阐明氧化砷的效应机制，我们以维甲酸耐药的细胞株MR-2为体外模型，研究As₂O₃对其影响。

材料和方法

　　1　制剂0.1％As₂O₃（哈尔滨医科大学附属第一医院生产）以磷酸缓冲液(PBS)配制成浓度为50μmol/L的储存液。1mmol/L全反式维甲酸(ATRA，Sigma公司）以无水乙醇配制。

　　2　细胞培养　MR-2细胞来源于APL细胞株NB4细胞的对ATRA耐药的细胞克隆,由Miller博士提供。以2×10⁵/ml接种于含和不含0.1和1.0μmol/L As₂O₃及1μmol/L ATRA的RPMI 1640培养液（内含10％牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml）中，在37℃、5%CO₂的条件下培养。使用台盼蓝染色法计数细胞及进行活力测定。

　　3　细胞形态及流式细胞仪检测　细胞经离心,涂片，Wright's染色后进行光镜观察。按文献［4］方法进行流式细胞仪检测。

　　4　免疫荧光分析　按文献［6］方法进行细胞涂片、固定，先后与抗PML抗体，荧光异硫氰酸酯标记的二抗（Boehringer Mannheim公司）孵育，荧光显微镜观察。

结　　果

　　1　MR-2细胞的基本特点　四氮唑蓝(NBT)还原试验显示1μmol/L ATRA处理的MR-2细胞其NBT还原值无变化，这明显不同于NB4细胞,后者在1μmol/L ATRA处理48小时后NBT还原值开始上升，并于72小时最明显（图1）;与未经ATRA处理的NB4细胞一样，Western检测显示MR-2表达PML-RARα融合蛋白，且免疫荧光分析显示MR-2细胞核内可见数百个细小荧光颗粒;与NB4细胞不同，经ATRA处理后，MR-2的PML/PML-RARα的分布并无明显改变;1μmol/L ATRA并不影响MR-2细胞的生长和活力（图2，3）。

图1　1μmol/L ATRA处理的NB4及MR-2细胞NBT还原反应

　　2　As₂O₃对MR-2细胞生长及活力的影响　1.0μmol/L As₂O₃处理72小时后可明显抑制MR-2细胞生长及活力，但0.1μmol/L As₂O₃对细胞生长及活力均无影响（图2，3）。

图2　As₂O₃及ATRA对MR-2细胞生长的影响

图3　As₂O₃及ATRA对MR-2细胞活力的影响

　　3　As₂O₃诱导MR-2细胞凋亡　1.0μmol/L As₂O₃处理72小时的MR-2细胞可见典型的凋亡形态学改变,且用药5天时最明显。流式细胞仪检测显示1.0μmol/L As₂O₃处理的MR-2细胞具有典型的凋亡细胞群，即DNA含量明显低于G₁期的亚G₁期细胞峰，且呈时间依赖性，而0.1μmol/L As₂O₃、1.0μmol/L ATRA及对照细胞均未见以上改变。

　　4　As₂O₃对PML-RARα融合蛋白的影响　1.0μmol/L As₂O₃作用24小时的MR-2细胞胞核及胞浆内均未见荧光颗粒，而对照中，0.1μmol/L As₂O₃及1μmol/L ATRA处理72小时的MR-2细胞胞核内可见细小的荧光颗粒。

　　5　As₂O₃ 不诱导MR-2细胞分化　经0.1及1.0μmol/L As₂O₃作用的MR-2细胞形态学观察及NBT试验均未显示细胞分化。

讨　　论

　　As₂O₃作为选择性诱导APL细胞凋亡药物开创了肿瘤治疗新思路。我们研究了其对于维甲酸耐药的APL细胞株MR-2的作用，发现As₂O₃不仅能诱导维甲酸敏感的细胞株NB4凋亡^［4］，而且能促进MR-2细胞凋亡，提示维甲酸与As₂O₃无交叉耐药。引起维甲酸耐药的主要原因为药代动力学改变，Delva等^［7］报道维甲酸耐药患者的APL细胞胞内维甲酸结合蛋白Ⅱ(CRABPⅡ)升高，致游离的维甲酸浓度下降而产生耐药；Kizaki等^［8］报道维甲酸耐药可能是细胞色素P450(CP450)活性增加，使维甲酸代谢增加。至今未报道As₂O₃胞内代谢与以上蛋白有关，由此推测两者无交叉耐药。

　　我们在研究中发现MR-2细胞中PML-RARα融合蛋白降解早于凋亡；陈国强等^［4］报道As₂O₃对NB4细胞作用中也存在此现象。另外，我院治疗的APL复发患者16例中仅有1例As₂O₃治疗未达到完全缓解，而此患者经逆转录-聚合酶链反应测试后证实无PML-RARα^［3］,提示PML-RARα可能为As₂O₃的靶蛋白。最近，朱军等^［9］研究证实As₂O₃降解PML-RARα中的PML组分。也有人报道PML-RARα融合蛋白可能为抑制细胞凋亡的癌蛋白^［10］，因此As₂O₃可能通过降解PML-RARα融合蛋白而诱导细胞凋亡。这些结果提示，对维甲酸耐药且有PML-RARα表达的APL复发患者可进行As₂O₃治疗，至于无PML-RARα融合蛋白的患者As₂O₃治疗是否有价值需进一步研究。

　　综上所述，As₂O₃可诱导维甲酸耐药，且具有PML-RARα融合蛋白的APL细胞凋亡，其可能的分子机制为降解PML-RARα蛋白。

　　本课题受国家自然科学基金(39670329)、杰出青年科学基金(39725011)、上海市青年启明星计划(96QB14021)和上海血液学研究所胡应洲基金资助

参 考 文 献

　　1　孙洪德，李元善，马玲，等.癌灵1号结合中医辨证治疗急性早幼粒白血病32例.中国中西医结合杂志，1992，12：170-171.

　　2　张鹏，王树叶，胡龙虎，等.三氧化二砷注射液治疗72例急性早幼粒细胞白血病.中华血液学杂志，1996，17：58-60.

　　3　Shen ZX,Chen GQ,Ni JH,et al.Use of arsenic trioxide (As₂O₃) in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL):Ⅱ clinical efficacy and pharmacokinetic in relapsed patients.Blood,1997,89:3354-3360.

　　4　Chen GQ, Zhu J,Shi XG, et al.In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As₂O₃) in the treatment of acute promyelocytic leukemia: As₂O₃ induces NB4 cell apoptosis with downregulation of Bcl-2 expression and modulation of PML-RARα/PML proteins.Blood,1996,88:1052-1061.

　　5　Chen GQ,Shi XG,Tang W,et al.Use of arsenic trioxide (As₂O₃) in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL) :Ⅰ　As₂O₃ exerts dose-dependent dual effects on APL cells.Blood,1997,89:3345-3353.

　　6　Zhu J,Shi XG,Chu HY,et al.Effect of retinoic acid isomers on proliferation,differentiation and PML relocation in the APL cell line NB4.Leukemia,1995,9:302-309.

　　7　Delva L,Cornic M,Balitrand N,et al.Resistance to all-trans retinoic acid therapy in relapsing acute promyelocytic leukemia:study of in vitro ATRA sensitivity and cellular retinoic acid binding protein levels in leukemia cells.Blood,1993,82:2175-2181.

　　8　Kizaki M,Ueno H,Yamazoe Y,et al.Mechanism of retinoid resistance in leukemia cells:possible role of cytochrome P450 and P-glycoprotein.Blood,1996,87:725-733.

　　9　Zhu J, Koken MHM,Quignon F,et al.Arsenic-induced PML targeting onto nuclear bodies:implications for the treatment of acute promyelocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:3978-3983.

　　10　Maede Y,Horiuchi F,Miyatake J,et al.Inhibition of growth and induction of apoptosis by all-trans retinoic acid in lymphoid cell lines transfected with the PML/RAR alpha fusion gene.Br J Haematol,1996,93:973-976.

(收稿：1997-07-10　　修回：1998-02-20)

(校对：董文革)