rhIL-3增强急性髓系白血病细胞对柔红霉素敏感性的研究

中华血液学杂志 1999年第1期第20卷 论著

作者：王景昌　王庆余　陈幸华　彭贤贵

单位：630038　重庆，第三军医大学新桥医院［王景昌(现在解放军第十医院)、王庆余、陈幸华、彭贤贵］

　　关键词： 白细胞介素3；白血病，髓样，急性；柔红霉素

　　【摘要】　目的　观察经重组人白细胞介素3(rhIL-3)刺激后急性髓系白血病(AML)细胞对柔红霉素(DNR)敏感性的变化。方法　用流式细胞仪、细胞形态学、联苯胺染色观察rhIL-3对AML细胞增殖与分化的影响;用荧光分光光度法测定AML细胞内DNR浓度;用半固体培养法观察CFU-AML产率。结果　①rhIL-3对体外培养的AML细胞具有促增殖作用,但无明显诱导分化作用;②rhIL-3不影响AML细胞对DNR的摄取与排泄平衡,但能增强AML细胞对DNR的敏感性。结论　rhIL-3与DNR联合应用,有可能提高临床治疗AML的疗效。

　　Study on the sensitization of acute myeloid leukemia cell to daunorubicin by recombinant human interleukin-3　WANG jingchang, WANG Qingyu,CHEN Xinghua, et al.Department of Hematology,Xin Qiao hospital,Third Military Medical University, Chongqing　630038

　　【Abstract】　Objective　To evaluate the effect of recombinant human interleukin-3(rhIL-3) on the sensitization of acute myeloid leukemia(AML) cells to daunorubicin(DNR).Methods　AML cells were cultured in a DNR-containing medium supplemented or not with rhIL-3. cFU-AML was assayed by semi-solid culture, proliferation and differentiation of aML cells were assayed by flow cytometry, cytomorphology and benzidine staining.Intracellular DNR concentration was measured by spectrophotofluorometry.Results　rhIL-3 could enhance the proliferation but not differentiation of AML cells in vitro, and had no effect on DNR intake and exclusion of AML cells while enhancing their sensitivity to DNR.Conclusion　rhIL-3 combined with DNR might improve the therapeutic effect of AML.

　　【Key words】　Interleukin-3　　Leukemia, myeloid, acute　　　Daunorubicin

　　细胞动力学研究表明,白血病细胞存在较多的非增殖期(G₀)或增殖较慢的细胞。这些细胞往往会逃逸化疗药物的杀伤,它的存在是白血病化疗失败和复发的重要原因之一^［1］。目前有关造血生长因子(HGFs)对造血细胞生长发育的调控作用日益受到重视。近年来发现部分HGFs,如GM-CSF、G-CSF、白细胞介素3(IL-3)等能增强白血病细胞对某些化疗药物，如阿糖胞苷(Ara-C)的敏感性^［2］。IL-3作为一种多系造血生长因子，在造血调节过程中具有重要作用。柔红霉素(DNR)是急性白血病化疗的常用药物。我们观察重组人IL-3(rhIL-3)联合DNR对原代白血病细胞(CFU-AML)集落生长的影响,以检测rhIL-3能否增强AML细胞对DNR的敏感性。

　　材料和方法

　　1　病例资料　初诊未治的AML患者10例，其中M₁、M₂、M₃、M₅各2例，M₄、M₆各1例,均经血象、骨髓象和细胞化学检查确诊。其中男性6例，女性4例,年龄15～49岁，平均27.5岁。

　　2　实验方法

　　2.1　骨髓单个核细胞的分离: 按常规进行骨髓穿刺,抽取骨髓2～3ml，Ficoll液密度梯度离心法分离单个核细胞，－196℃液氮冻存待用。

　　2.2　液体悬浮培养: 将分离所得单个核细胞调制成浓度为5×10⁵/ml细胞悬液,以每瓶10ml为一体系,每组两瓶。IL-3组加rhIL-3(100U/ml),对照组以RPMI1640液代替rhIL-3为阴性对照。置37℃、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度条件下培养2～3天,然后分别进行细胞周期、细胞形态学、细胞内药物浓度测定及集落培养等。

　　2.3　细胞周期测定: 上述经液体悬浮培养的白血病细胞,经PBS(pH7.2)洗涤3次，经体积分数为70％的冷乙醇固定后4℃存放待测。测定前去除固定液，加RNA酶Ⅰ溶液作用10分钟,再加入碘化丙锭染液,4℃冰箱避光染色20分钟,用200目过滤网过滤后上流式细胞仪(FCM)，每个样本测定10000个细胞,数据经计算机处理分析得出细胞周期各时相比例。

　　2.4　细胞形态学观察和细胞化学检测:液体悬浮培养的白血病细胞分别进行瑞氏染色和联苯胺染色,行细胞形态学分类和联苯胺染色阳性细胞计数。

　　2.5　细胞集落培养及药敏试验: 取液体悬浮培养2天的细胞，加入DNR(100ng/ml)后作用24小时，按文献［3］方法进行CFU-AML集落半固体培养,观察细胞集落产率情况,计算集落产率。

　　2.6　白血病细胞内DNR浓度测定:经液体悬浮培养3天后的细胞悬液,加DNR 100ng/ml，37℃振荡水浴孵育,分别于15，30，60，120，180，240分钟取出2ml混匀的细胞悬液,用冷PBS(0.15mol/L，pH7.4)2ml终止代谢,离心弃上清,用PBS洗2遍,再用0.5ml pBS悬浮,用CPS-IA型超声破碎仪破碎细胞1分钟,取一部分样品采用考马斯亮蓝法测定微量蛋白,以纯化牛血清白蛋白作对照。剩余部分加300g/L三氯乙酸(按每毫升细胞破碎液加0.5ml三氯乙酸)，4000r/min离心30分钟,上清液在波长475nm条件下测定荧光强度。根据测定前绘制的标准曲线计算出单位重量细胞蛋白的DNR浓度。

　　3　统计学处理　实验结果以均数±标准差(±s)表示,采用配对t检验。

　　结果

　　1　rhIL-3对AML细胞周期分布的影响　rhIL-3处理后G₀/G₁期白血病细胞比例显著降低(P＜0.01)，S期比例显著升高(P＜0.01)，但是各患者白血病细胞对rhIL-3的反应有差异。有1例(例4)对rhIL-3无明显反应(表1)。

表1　rhIL-3对AML白血病细胞周期分布的影响(培养3天)

例号	FAB分型	原+早幼 　　细胞比例	细胞周期
			对照组			rhIL-3组
			G0/G1	S	G2/M	G0/G1	S	G2/M
1	M1	0.92	0.867	0.101	0.032	0.798	0.164	0.038
2	M1	0.76	0.792	0.164	0.044	0.727	0.231	0.043
3	M2	0.88	0.801	0.159	0.040	0.672	0.235	0.092
4	M3	0.74	0.847	0.126	0.027	0.832	0.136	0.032
5	M3	0.85	0.678	0.297	0.025	0.604	0.368	0.028
6	M4	0.66	0.915	0.094	0.011	0.813	0.156	0.041
7	M5	0.84	0.752	0.211	0.084	0.592	0.378	0.030
8	M2	0.91	0.864	0.063	0.073	0.761	0.196	0.043
9	M5	0.78	0.783	0.165	0.052	0.668	0.277	0.055
10	M6	0.81	0.920	0.063	0.017	0.834	0.134	0.032
±s		0.81±0.07	0.819±0.079	0.144±0.072	0.040±0.024	0.730±0.092*	0.228±0.090*	0.043±0.019＃

　　与对照组比较，*P＜0.01；#P＞0.05

　　2　rhIL-3对AML细胞分化的影响　rhIL-3作用后，AML中幼粒(单)以下阶段的细胞比例和联苯胺染色阳性率与相应对照组比较差异无显著性(P＞0.05)(表2)。

表2　rhIL-3对白血病细胞分化的影响

　　与对照组比较,*P＞0.053　rhIL-3对AML细胞内DNR浓度的影响　在各观察时相点, rhIL-3组与相应对照组比较,AML细胞内DNR浓度差异不显著(P＞0.05，见图1)。

图1　rhIL-3对AML细胞摄取DNR的影响

　　4　rhIL-3联合DNR对CFU-AML集落生长的影响　rhIL-3+DNR组CFU-AML集落产率为(20.64±5.92)%, dNR组为(39.24±8.19)%，两组比较差异有显著性(P＜0.01)。

　　讨论

　　rhIL-3是重要的HGFs之一,它能刺激早期多能造血干细胞增殖,并促使其向粒、红、巨核系分化,与其它HGFs构成复杂的细胞因子网络,调控机体的造血过程^［4］。对正常骨髓细胞的研究已证明，rhIL-3不仅能促进³H-TdR掺入率的增加,而且能够在半固体培养中刺激多系克隆的形成。因此,临床将其应用于治疗各种原因引起的骨髓衰竭。白血病细胞的主要生物学特征之一是其增殖与分化过程脱偶联。有研究表明，GM-CSF、G-CSF、IL-3刺激可改变AML细胞G₀/G₁期与G₂/M期细胞比例,并因此增强Ara-C对白血病细胞集落生长的抑制率。关于HGFs能否影响白血病细胞对DNR敏感性的文献报道较少,且结论不一。本研究中我们以rh iL-3为刺激因子,对AML细胞作体外液体悬浮培养,观察AML细胞周期变化。结果显示,在体外rh iL-3具有刺激AML细胞增加S期细胞比例的作用,与文献报道的结果一致,证实rhIL-3是AML细胞体外培养中有效的刺激因子。与此同时,进行细胞形态学观察和联苯胺染色计数，结果表明，rhIL-3对AML细胞无诱导分化作用。在此基础上通过体外半固体CFU-AML集落培养发现：rhIL-3联合DNR作用，可使CFU-AML集落的产率比对照组显著减低,因此认为rhIL-3与DNR联合可增强AML细胞对DNR的敏感性。

　　DNR属于蒽环类抗肿瘤药物,作用机制复杂,对白血病细胞的毒性作用主要通过与细胞内DNA拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)结合,形成DNR-酶-DNA复合物,启动细胞凋亡^［5］。有人认为白血病细胞内TopoⅡ水平与细胞所在细胞周期阶段有关，G₀期细胞内TopoⅡ水平很低,随着细胞进入S期，Topo Ⅱ水平会迅速升高^［6］。本研究的实验结果表明，rhIL-3能刺激AML细胞进入S期而不影响AML细胞内DNR浓度。可能rhIL-3刺激白血病S期细胞比例增加,从而提高了细胞内TopoⅡ水平,促进DNR嵌入DNA，加速了AML细胞的死亡。此外,在FCM实验中对rhIL-3无明显反应的1例(例4，M₃)在集落培养中也表现出对DNR不敏感,从另一方面也支持上述观点。

　　所以，rhIL-3和DNR联合应用，有可能提高临床治疗AML的疗效。

　　本课题受全军临床医学中、青年人才基金资助

　　参考文献

　　[1]　Greenberg ML,Chanana AD, cronkite EP. The generation time of human leukemic myeloblasts. Lab Invest,1972,26:245-252.

　　[2]　Brons PPT, Haanen C, Boezeman JBM, et al. Proliferation patterns in acute myeloid leukemia:leukemic clonogenic growth and in vivo cell cyclekinetics. ann Hematol,1993, 66:225-232.

　　[3]　Boekhorst PA, Lowenberg B, Sonneveld P. Enhanced chemosensitivity in acute myeloid leukemia by the haematopoietic growth factor: a comparison of MTT assay with a clonogenic assay. Leukemia,1993,7:1637-1644.

　　[4]　Yang YC, Clark SC. Interleukin-3: molecular biology and biological activities. Hematol/Oncol Clin North Am, 1989,3:441-448.

　　[5]　Liu LF. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annu Rev biochem,1989,58:351-357.

　　[6]　Hsiang YH, Wu HY, Liu LF. Proliferation dependent regulation of DNA topoisomerase Ⅱ in culture human cell. Cancer Res,1988,48:3230-3239.

收稿：1998-02-25　　修回：1998-08-24(校对：王叶青)