儿童急性白血病患者MTS1基因检测及其临床意义
中华血液学杂志 1999年第7期第20卷 研究报告
作者：王宏 王军 朱绍先 汤有才 张欣欣 郑娟 冯剑飞 栾斌
单位：450052郑州，河南医科大学第三附属医院
我们采用聚合酶链反应(PCR)和PCR单链构象多态性分析(SSCP)技术研究了国内儿童急性白血病细胞中MTS1基因的纯合性缺失和突变情况，以探讨MTS1基因在儿童急性白血病发生、发展中的变化规律和意义。
对象和方法
1 研究对象 儿童急性白血病患者79例，均为1988年8月～1997年8月在我院初治的住院患儿。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)50例，男34例，女16例，年龄6个月～14岁，平均5.6岁。按全国血液学会议诊疗建议[1]分型：高危型32例，标危型18例。截止1997年8月，27例已死亡。急性非淋巴细胞白血病(ANLL)29例，男13例，女16例，年龄8个月～14岁，平均6.7岁，已死亡20例。20名正常儿童骨髓作为对照。
2 标本收集及DNA提取和浓度测定 用无菌手术刀片将已染色存档的骨髓涂片(涂片均为化疗前所取，洁净、均匀、无霉变，幼稚细胞数＞0.70)上的细胞仔细刮下，加入细胞裂解液和蛋白酶K等，摇匀后55℃孵育6小时，采用酚-氯仿法使DNA析出，再加入TE缓冲液使DNA溶解后，用紫外分光光度仪测定其在260nm处的A值，依下式计算样本的DNA浓度，并均调整浓度为30～50ng/μl。
3 MTS1基因的PCR扩增及纯合性缺失检测 MTS1基因及标准内对照基因β-actin的PCR扩增引物序列及退火温度见表1。取反应体系25μl(包括模板DNA5μl，上、下游引物各0.5μl，4mmol/LdNTPs1.6μl,TaqDNA聚合酶0.5μl，PCR上样缓冲液2.5μl，DMSO1μl，加三蒸水至25μl)，石蜡油25μl于PCR扩增仪上反应，经35个循环后，72℃延伸5分钟。取10μl反应产物，于含0.5μg/ml溴化乙锭的15g/L琼脂糖凝胶上电泳，以100bp梯度DNA为分子量标准，紫外灯下观察，若在相应位置有清晰的扩增带，照相并保留进行SSCP分析，无特异扩增带标本，视为MTS1基因的纯合性缺失(图1)。
表1 MTS1及β-actin基因PCR扩增引物序列及退火温度
| 外显子 |
序列 |
产物（bp) |
退火温度 |
| 1 |
5'-GAAGAAAGAGGAGGGGCTG-3' |
343 |
59℃ |
| |
5'-GCGCTACCTGATTCCAATTC-3' |
|
|
| 2A |
5'-ACAAGCTCCCTTTCCGTCATGCCG-3' |
244 |
59℃ |
| |
5'-CCAGGCATCGCGCACGTCCA-3' |
|
|
| 2B |
5'-TTCCTGGACACGCTGGTGGT-3' |
242 |
63℃ |
| |
5'-TCTGAGCTTTGGAAGCTCTCAG-3' |
|
|
| β-actin |
5'-GAATTCATGTTTGAGACCTTCAA-3' |
326 |
55℃ |
| |
5'-CCGGATCCATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3' |
|
|
4 MTS1基因突变的PCR-SSCP检测 取5μlPCR扩增产物，与5μlSSCP上样缓冲液(体积分数为95％的去离子甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.5g/L的溴酚蓝、二甲苯青蓝FF)混合，沸水中煮10分钟，立即放入冰水中，用微量注射器依次注入含20g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳槽孔内4℃冰箱中电泳12～16小时，小心将凝胶揭下，固定于150ml体积分数为30％乙醇＋10％乙酸中，摇床摇动12小时，洗涤3次后用1g/L硝酸银染色30分钟，倒去染色液，加入25g/LNa2CO3和体积分数为0.02％的甲醛的混合液，显色至胶中出现清晰电泳条带后终止反应，封胶后与正常对照比较，有突变的标本呈现异常泳动条带，包括单链带增多、缺失或泳动变位。
5 统计学处理 采用计算机SDAS卫生统计软件包进行两样本率比较的χ2检验。
结果
1 PCR扩增结果及纯合性缺失情况 全部正常对照骨髓DNA经MTS1基因第1外显子和第2外显子上、下段引物引导扩增后，琼脂糖电泳观察均出现亮度基本一致的扩增产物带，而部分儿童急性白血病患者骨髓标本则无特异扩增带，视为纯合性缺失(图1)。其中ALL患者50例中有19例存在MTS1基因纯合性缺失，缺失率为37.1％。缺失位于第1外显子者3例，第2外显子上段11例，第2外显子下段5例。ALL患者男性与女性、高危与标危、死亡与存活组的MTS1基因缺失情况见表2。ANLL患者29例中有3例MTS1基因纯合性缺失，缺失率10.3％，缺失位于第2外显子上段2例，下段1例。
标本4，7MTS1基因第2外显子纯合性缺失
图1 MTS1基因第2外显子上段及PCR扩增产物
2 MTS1基因突变情况 ALL患者50例中有4例存在MTS1基因突变(表2)，突变率为8％。其中突变点位于第2外显子上段者3例，下段者1例，第1外显子未发现突变。ANLL患者29例和正常儿童20名骨髓细胞DNA中均未见MTS1基因突变。
表2 ALL患者骨髓细胞中MTS1基因纯合性缺失及突变情况
| 组别 |
例数 |
缺失例数 |
缺失率（％） |
突变例数 |
突变率（％） |
| ALL |
50 |
19 |
37.1 |
4 |
8.0 |
| 男性组 |
34 |
14 |
41.2 |
4 |
11.8 |
| 女性组 |
16 |
5 |
31.2 |
0 |
0 |
| 高危组 |
32 |
16 |
50.0 |
2 |
18.2 |
| 标危组 |
18 |
3 |
16.7 |
2 |
11.1 |
| 死亡组 |
27 |
14 |
51.9 |
3 |
11.1 |
| 存活组 |
23 |
5 |
21.7 |
1 |
4.3 |
讨论
我们的研究显示,儿童ALL中MTS1基因纯合性缺失率显著高于ANLL(P〈0.01)及正常儿童(P〈0.05)；后二者比较差异无显著性(P＞0.1)。说明MTS1基因的纯合性缺失与儿童ALL的发生关系密切，而与ANLL关系不大，这与Maesawa等[2]的观点相一致。在对儿童ALL的研究中发现,MTS1基因纯合性缺失率在男性和女性患者间差异无显著性(P＞0.1)，而高危和标危组、死亡和存活组间差异均有显著意义(P值均〈0.05)。提示MTS1基因纯合性缺失的存在增加了儿童ALL复发和死亡的危险性，故MTS1基因检测可作为高危险性指标之一，用于ALL患者的预后判断。MTS1基因纯合性缺失主要集中在第2外显子上段，这与Ohnishi等[3]的报道相似。
在对MTS1基因突变的研究中，儿童ANLL和正常对照骨髓细胞DNA中均未见突变，儿童ALL中突变率仅为8％，三者间统计学处理差异无显著性。MTS1基因突变与白血病的发生和预后无明显关系。
我们成功地从已染色存档的骨髓涂片刮取物中提取出DNA，并获得满意的基因扩增特异性产物，为临床进行血液病的分子生物学研究，特别是回顾性研究提供一个新的较好途径。
参考文献：
1 小儿急性白血病诊疗建议(修订草案).中华儿科杂志，1993，31：285-287.
2 Maesawa C, Tamura G, Nishizuka S, et al. Inactivition of the CDKN2 gene by homozygous deletion and de-nover-methylation is associated with advanced stage esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res, 1996, 56 : 3875-3878.
3 Ohnishi H, Kawamura M, Ida K, et al. Homozygous deletions of P16(MTS1) gene are frequent but mutations are infrequent in childhood T cell acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1995, 86:1269-1275.
收稿：1998-07-13 修回：1999-01-25
校对：张吉贤
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