急性早幼粒细胞白血病患者血清及NB4细胞上清对正常粒系造血功能的影响
中华血液学杂志 1999年第7期第20卷 论著
作者：周荣富 孙关林 吴文 邬维礼 王振义
单位：孙关林 吴文 邬维礼 王振义 上海第二医科大学附属瑞金医院、上海血液学研究所 200025；周荣富 南京医科大学第二附属医院 210011
关键词： 白血病,早幼粒细胞,急性；维甲酸；肿瘤坏死因子；粒细胞集落刺激因子；干扰素Ⅱ型
摘要 目的探讨急性早幼粒细胞白血病(APL)患者血清对正常粒单核系祖细胞(CFU-GM)生长的影响及其抑制活性变化的有关因素。方法用细胞培养方法动态观察了24例APL患者在全反式维甲酸(ATRA)治疗过程中,其血清对正常CFUGM生长的影响;用ELISA和生物活性法分别检测血清中粒细胞集落刺激因子(G-CSF）、γ干扰素(IFN-γ)及肿瘤坏死因子(TNF)活性。结果治疗前,血清对CFUGM的生长呈抑制作用,抑制活性明显高于骨髓缓解时和正常血清(P0.01);治疗过程中,血清对CFU-GM的抑制活性逐渐加强,在白细胞达高峰前3～6天最强,然后逐渐减弱;骨髓缓解时,血清对CFU-GM的抑制活性明显下降,与正常血清比较，差异无统计学意义。血清对正常CFUGM抑制活性与患者骨髓白血病祖细胞(CFU-L)、早幼粒细胞百分率呈正相关,与骨髓CFU-GM呈负相关，与血清G-CSF含量或TNF活性间无线性相关。血清IFN-γ活性为阴性。结论①未治疗的APL患者血清对正常粒单核系造血有抑制作用。ATRA治疗APL取得缓解的机制之一,是通过诱导白血病细胞分化成熟,造血抑制活性不断减低,正常造血得以恢复；②血清抑制活性的异质性除与白血病细胞有关外,尚与其它细胞因子参与有关。
The effects of sera of acute promyelocytic leukemia patients and culture supernates of NB4 cells on normal granulo-macrophage hematopoiesis
ZHOU Rongfu, SUN Guanlin, WU Wen, et al
Ruijin Hospital,Shanghai Institute of Hematology,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025
Abstract Objective To explore the inhibitory activity of sera from acute promyelocytic leukemia(APL) patients on the growth of granular-macrophage progenitors(CFU-GM) and factors affecting the inhibitory activity. Methods Sera of 24 APL patients on the all-trans retinoic acid(ATRA) therapy course were kinetically obtained for cellular culture assay.Meanwhile,granulocyte-colony-stimulating-factor(G-CSF),interferon γ and tumor necrosis factor(TNF) activities in the patient serum and supernate of NB4 cell culture were detected.Results Before treatment, there was an inhibitory activity on CFU-GM growth in the sera of APL patients and it was statistically higher than that in remission patients and controls(P0.01).As the treatment going on the activity was gradually increased,reached its maximum 3～ 6 days prior to the peak of white blood cell(WBC) and declined to normal when bone marrow remission was obtained.It was positively correlated with the number of CFU-L and the percentage of promyelocyte in bone marrow,negatively with the number of CFU-GM but not with serum G-CSF and TNF activity.Serum G-CSF level was positively correlated with the number of WBC(P 0.05).No serum IFN-γ activity was detected in the sera. Conclusions ① One of the therapeutic mechanisms of ATRA on APL is that ATRA induces APL cell maturation thus reduces the serum inhibitory activity on normal hematopiesis.② The inhibitory activity of APL patient serum on normal hemopoiesis consists of complicated factors.
Key words Leukemia,promyelocytic,acute Retinoic acid Tumor necrosis factor Granulocyte colony stimulating factor Interferon,type Ⅱ
以前的研究中,我们发现急性早幼粒细胞白血病(APL)患者血清对正常骨髓红系和巨核系祖细胞的生长有抑制作用[1，2]。近来,我们用细胞培养的方法,动态观察了APL患者全反式维甲酸(ATRA)治疗过程中,其血清对正常骨髓粒单核系祖细胞(CFU-GM)生长的影响,同时测定部分患者血清中粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、γ干扰素(IFN-γ)水平,以探讨它们在血清抑制活性中的作用。
材料和方法
1 临床资料、血清及骨髓标本处理 24例APL患者的临床特点、血清、骨髓标本收集及处理与文献[1,2]相同。
2 细胞培养
2.1 NB4细胞上清液的制备：取对数生长期的NB4细胞株,按终浓度为1×106/ml加入培养体系进行传代培养。设对照、ATRA（上海第六制药厂,终浓度10－7mol/L)、植物血凝素（PHA,Sigma公司,终浓度1g/L)和ATRA＋PHA四组,37℃，体积分数为5％的CO2培养箱内分别培养24，72小时后取出,收集上清液,过滤后－80℃冻存。
2.2 CFU-GM、白血病祖细胞(CFU-L)培养：按文献[3]操作。
2.3 患者血清、NB4细胞上清液、ATRA对正常骨髓CFUGM生长的影响：按体系体积的10％分别加入患者血清(治疗前、白细胞高峰前3或6天、白细胞高峰时、白细胞高峰后3或6天及缓解时的血清)、NB4细胞上清液及ATRA,设空白对照,均设复皿。ATRA的终浓度分别为10－5，10－6，10－7，10－8，10－9mol/L。血清抑制活性以抑制率(IR)表示：
3 细胞因子的检测
3.1 患者血清、NB4细胞的上清液及其冻融物中G-CSF的检测：以ELISA法[4]进行。
3.2 NB4细胞上清液TNF活性的测定：按文献[1，2]方法。
3.3 血清及NB4细胞上清液中IFN-γ的测定：按试剂盒(第二军医大学微生物教研室)说明进行。
4 统计学处理 结果均为均数±标准误(x±sx),采用t或t'检验,直线相关和Spearman等级相关分析。
结果
1 APL患者WBC和早幼粒细胞计数的变化及其血清对正常骨髓CFU-GM生长的影响结果见表1。
表1 APL患者WBC和早幼粒细胞的变化及其血清对正常骨髓CFU-GM的影响
| 血清 |
例数 |
WBC（×109/L） |
早幼粒细胞（×109/L） |
抑制率（％） |
| 治疗前 |
24 |
11.12±4.10 |
4.27±1.72 |
38.40±3.95 |
| 高峰前3或6天 |
21 |
22.16±5.13 |
11.90±4.19 |
48.25±3.31 |
| 高峰时 |
21 |
33.22±6.35＊ |
11.46±4.35 |
44.91±4.87 |
| 高峰后3或6天 |
17 |
15.99±3.98 |
4.71±2.20 |
35.02±3.44 |
| 缓解时 |
23 |
4.79±0.52 |
0 |
8.96±3.28＃ |
| 正常 |
10 |
|
|
6.00±3.83＃ |
注：与治疗前相比，＊P0.005,＃P0.001
表1表明，随着ATRA的治疗,患者血清对正常骨髓CFU-GM的抑制活性有所增加,而且以白细胞达高峰前3或6天时为最高,然后下降,与高峰后3或6天时的血清抑制活性相比,差异有统计学意义(P0.05)。骨髓缓解时虽略高于正常,但两者间差异无统计学意义(P＞0.05)。早幼粒细胞计数在白细胞达高峰前3或6天时为最高,然后下降。
2 NB4细胞上清液对正常CFU-GM生长的影响结果见表2。
表2 NB4细胞上清液对正常骨髓CFUGM生长的影响
| 组别 |
例数 |
培养不同时间CFUGM集落数（/106细胞） |
P值＃ |
| 24h |
72h |
| 空白对照 |
4 |
44.8±3.8 |
44.8±3.8 |
|
| 上清液 |
4 |
24.0±1.5 |
29.5±1.0 |
0.025 |
| ＋ATRA |
4 |
29.3±1.7 |
36.5±1.5 |
0.025 |
| ＋PHA |
4 |
28.3±0.1 |
38.8±2.0 |
0.025 |
| ＋ATRA＋PHA |
4 |
33.8±3.1 |
39.5±1.3 |
|
注：上清液组与空白对照组相比较，P0.05;＃P值为72小时组和24小时组比较
表2表明,NB4细胞上清液对正常人骨髓CFU-GM生长有抑制作用,加入ATRA、PHA并未使抑制作用增强,提示ATRA、PHA不能增加NB4细胞释放抑制性因子。随着培养时间的延长,NB4细胞培养上清液对正常骨髓CFU-GM生长的抑制作用有减弱趋势。
3 ATRA对正常CFU-GM生长的影响结果见图1。当浓度为10－8～10－6mol/L时,ATRA对正常CFU-GM生长有促进作用,而10－5mol/L的ATRA呈现抑制作用。
图1 不同浓度ATRA对正常CFU-GM生长的影响
4 ATRA治疗过程中骨髓CFU-L、CFU-GM的变化治疗前患者（23例)骨髓祖细胞培养结果为每106细胞CFUL、CFUGM集落数分别为313.5±17.5,19.5±0.9；治疗中(11例)为196.2±4.7,23.6±1.9；缓解时(17例)为14.2±2.6,36.7±2.0。表明随病情缓解CFUL明显减少，而CFUGM显著增加(P0.05)。
5 细胞因子的测定
5.1 患者血清G-CSF检出阳性率及血清对CFU-GM抑制率的变化见表3。
表3 白细胞高峰前、后患者血清G-CSF阳性率及对CFU-GM抑制率的变化
| 血清 |
G-CSF阳性率（％） |
CFU-GM抑制率(％) |
| 治疗前 |
20.80(24) |
38.40(24) |
| 高峰前3或6天 |
57.00(21) |
48.30(21) |
| 高峰时 |
45.00(20) |
44.90(21) |
| 高峰后3或6天 |
26.70(15) |
55.00(17) |
| 缓解时 |
10.50(19) |
8.96(23) |
注：括号内为检测例数
如表3所示,在检测的99例次APL患者血清中,白细胞高峰前3或6天患者血清GCSF阳性率最高,高峰时阳性率已开始下降。而血清对CFUGM的抑制活性也有类似变化。
5.2 NB4细胞上清液及其冻融物中GCSF活性的测定：结果均为阴性(60pg/ml)。
5.3 NB4细胞上清液中TNF活性的测定：结果见图2。
图2 药物对NB4细胞上清液中TNF活性的影响（n=3）
图2表明，NB4细胞培养上清液中有TNF活性,此活性随着培养时间延长有下降趋势。ATRA及PHA可使TNF活性减弱。
5.4 APL患者血清、NB4细胞上清液中IFN-γ的检测:应用ABCELISA法测定了8例APL患者血清、NB4细胞上清液中IFNγ的活性,结果均为阴性(10ng/ml)。
6 患者血清抑制活性与细胞因子等参数间的关系 经直线相关分析,患者血清对正常CFUGM的抑制活性与骨髓内CFUL、早幼粒细胞比例呈正相关(r值分别为0.375，0.679,P值分别0.05，0.01),与骨髓内CFUGM数呈负相关(r="－"0.348,P0.05);Spearman等级相关分析提示GCSF含量和WBC呈正相关(P0.05)、与血清对CFUGM的抑制活性大小无线性相关。
讨论
本研究结果表明:①未治疗的APL患者血清对正常骨髓CFUGM有抑制活性;②血清对CFUGM的抑制活性在白细胞高峰前3～6天较治疗前增高,但差异无统计学意义(P＞0.05),然后逐渐减弱,在骨髓缓解时,血清对CFUGM的抑制率显著低于治疗前及白细胞高峰时的抑制率(P0.001),与正常血清相比差异无统计学意义,此时患者骨髓CFU-GM为36.7/106细胞,基本在正常范围,白细胞为(4.79±0.52)×109/L;③患者血清无论是对粒单核系、红系还是对巨核系祖细胞的抑制活性均与骨髓CFU-L和早幼粒白血病细胞的百分率呈正相关[1，2]，NB4细胞培养上清液对正常骨髓CFU-GM的集落形成有抑制作用,提示这种抑制活性可能来源于白血病细胞;④同一患者的血清对粒单核、红、巨核系均具有不同程度的抑制作用[1，2]，随治疗其抑制程度变化也不一致,说明血清中有多种其它因子参与抑制作用,它们除可能由白血病细胞释放外,也可能由其它细胞产生,是多因素综合作用导致正常祖细胞的增殖和分化功能障碍；⑤ATRA在血清中可能促进CFU-GM的增殖、分化，我们的体外实验结果及文献[5]说明了此点。ATRA不仅加强造血祖细胞(HPC)对其它集落刺激因子的敏感性,而且促进HPC向粒系分化。
G-CSF是粒系造血的生理调节剂。体外实验表明G-CSF与ATRA联合应用可加强ATRA诱导的APL细胞分化[6]。本研究中G-CSF的测定结果与既往的研究结果[7]相似,但G-CSF含量与血清对CFU-GM的抑制活性大小无线性相关。推测血清G-CSF可能与ATRA一道加速骨髓内成熟粒细胞、APL细胞进入外周血液循环,从而使血清对粒单核系的抑制活性上升,但G-CSF也可抵消一部分血清对粒-单核系的抑制活性。NB4细胞、APL骨髓单个核细胞培养上清及细胞冻融物(另文发表)中GM-CSF均为阴性。有报道[8]APL细胞虽经ATRA诱导,也不表达或分泌GM-CSF,但ATRA可激活骨髓基质细胞,使其分泌细胞因子,故可推测血清中GCSF的增加是由于骨髓基质细胞及其它产生G-CSF的细胞被ATRA激活后表达和分泌增加所致。
TNF是造血负调控因子。已知APL细胞均可自分泌TNFα,我们在NB4细胞株培养上清中能检测到TNF活性。这种在白血病骨髓局部产生的内源性TNF,可诱导白血病细胞分泌细胞因子,同时可通过抑制正常造血而为白血病细胞增殖提供有利条件[9]。故当ATRA诱导APL患者至缓解时,白血病细胞已明显减少,由其产生的TNF活性显著下降,正常的造血功能得以恢复。但患者血清TNF活性与血清对CFU-GM的抑制活性间无线性关系(r=0.253,P＞0.05),提示尚有其它因素(抑制性或刺激性因子)在起作用。
IFN-γ为非特异性造血抑制因子。范开等[10]曾发现1例M3患者白血病细胞产生IFN-γ,也有人报道白血病细胞系和正常祖细胞在分化过程中能产生IFN-γ。但我们应用ELISA法未能检测出NB4上清液、APL患者血清中的IFN-γ活性。这可能是因试剂的敏感度不够(＞10ng/ml为阳性)或检测的标本数少。故IFN-γ在血清造血抑制活性中的实际意义有待进一步研究。
综上所述：①APL患者血清对正常粒单核系造血功能有抑制活性。ATRA诱导APL取得缓解的机制之一，是诱导白血病细胞分化成熟，逐渐减少这种抑制活性释放，使正常造血功能得以恢复。此外,ATRA能促进正常CFU-GM的增殖与分化,参与该病理变化;②APL患者血清的这种抑制活性可能有异质性,其本质尚待进一步研究。
参考文献：
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收稿：1998-08-17 修回：1999-03-01
校对：王汝瑞
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