急性白血病患者周期蛋白D1mRNA表达及其临床意义

中华血液学杂志 1999年第7期第20卷 论著

作者：李红华　汪月增　楼方定　靳海杰　史子江　张苗

单位：100853北京，解放军总医院血液科

　　关键词： 白血病；细胞周期蛋白类；聚合酶链反应

　　摘要　目的检测急性白血病患者周期蛋白(cyclin) D₁ mRNA的表达，并探讨其与临床的关系。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测65例急性白血病患者及5名正常人骨髓细胞cyclin D₁ mRNA。结果正常骨髓未检测到cyclin D₁ mRNA表达；急性白血病患者阳性率26.2％，急性淋巴细胞白血病与急性非淋巴细胞白血病之间差异无显著性；复发组患者的cyclin D₁ mRNA阳性率(63.6％)明显高于初治组(21.4％)及缓解组(8.3％)。结论急性白血病患者中有cyclin D₁ mRNA过度表达的情况，且与临床复发关系较为密切。

Expression of cyclin D1 mRNA in acute leukemia patients and its clinical implication

LI Honghua　WANG Yuezeng　LOU Fangding　et al.

　　Department of Hematology,General Hospital of PLA,Beijing 100853

　　Abstract Objective To determine the expression of cyclin D1 gene in patients with acute leukemia and evaluate the relationship between cyclin D1 expression and treatment outcomes.Methods The expression of cyclin D1 mRNA was determined in bone marrow cells from 65 acute leukemia patients and 5 normal subjects by RT-PCR technique.Results Cyclin D1 mRNA was negative in normal bone marrow cells.Among leukemia patients,the rate of cyclin D1 expression was 26.2％ , and the highest(63.6％ ) rate was in the relapse group and the lowest(8.3％ ) in the CR group.Relapse rate of the patients with cyclin D1 expression was higher than that of those with negative expression over 1～ 13 months follow-up.Conclusion Overexpression of cyclin D1 does exist in acute leukemia patients and is correlated with the disease progression, especially with relapse.

　　Key words Leukemia Cyclin Polymerase chain reaction

　　近几年研究发现在食管癌、乳腺癌、肠癌、肝癌、胰腺癌中均有周期蛋白（cyclin）D1基因扩增、cyclin D₁ mRNA转录异常和相关蛋白的过度表达[1-4]。我们采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术，对急性白血病患者骨髓细胞cyclin D₁ mRNA进行检测，并探讨其与临床的关系。

　　对象和方法

　　1　对象　急性白血病患者骨髓，取自1997年1月～1998年2月来我院就诊及收治的成人急性白血病患者65例，其中急性非淋巴细胞白血病（ANLL）45例(包括由骨髓增生异常综合征转变而来5例、慢性粒细胞白血病急变1例及混合型白血病2例），急性淋巴细胞白血病（ALL）20例；初治42例，复发11例，缓解12例。均经临床及实验室检查确诊，符合FAB诊断标准。男40例，女25例，年龄12～75岁，平均33.8岁。随访时间为1～13个月，中位时间7个月。正常骨髓取自我院5例胸外科非肿瘤患者手术切除肋骨。

　　2　PCR引物　cyclin D₁引物参照文献[4]、β-actin引物参照文献[5]设计合成。

　　3　PCR

　　3.1　细胞总RNA提取：取肝素抗凝骨髓1ml，用淋巴细胞分离液(Ficoll，相对密度1.077)分离单个核细胞，采用RNA提取一步法提取细胞总RNA。

　　3.2　逆转录合成cDNA：反应体系25μl，含RNA5μg，dNTPs(2.5mmol/L)4μl，OligodT10μmol/L，逆转录酶(MMLV)100U，37℃恒温水浴反应1小时，之后100℃5分钟。

　　3.3　PCR扩增：反应体系50μl，含逆转录产物4μl，dNTPs(2.5mmol/L)4μl，cyclinD1引物各20pmol，β-actin引物各25pmol，Taq酶2U。扩增条件为：94℃变性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸60秒，共35个循环，最后72℃延伸5分钟。阳性对照用cyclinD1质粒DNA，阴性对照用空白对照（去离子水）以及已知阴性的标本。每次扩增都有阴性和阳性对照。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　4　统计学处理采用χ2检验。

　　1　5例正常骨髓均未检测到cyclinD1mRNA的表达。

　　2　本组急性白血病患者65例中cyclinD1mRNA阳性表达17例（图1），阳性率为26.2％。其中ANLL和ALL患者的阳性率分别为20.0％（45例中有9例阳性）和40.0％（20例中有8例阳性），差异无统计学意义，χ2=1.41,P＞0.05。

　　M：pBR322/HinfI;1:空白对照；2：阳性对照；3～7:患者标本，其中5为阳性病例

　　图1　RT-PCR检测cyclinD1mRNA表达

　　3　初治的急性白血病患者42例中有9例阳性表达，阳性率为21.4％;复发的患者11例中有7例阳性，阳性率为63.6％;缓解期患者12例中仅1例阳性，阳性率为8.3％。组间差异有统计学意义，χ2=10.46,P〈0.01。

　　4　在cyclin D₁ mRNA阳性的17例患者中，复发者7例，占41.2％，而在cyclin D₁ mRNA阴性的48例患者中复发者仅有4例，占8.3％，差异有显著意义，χ2=9.63,P〈0.01。

　　5　9例cyclinD1mRNA阳性初治患者中有2例分别于1个半月及6个月后复发，而阴性初治患者33例在相当的随访期间未见复发者；缓解期患者12例中，1例阳性患者在4个月后复发，而11例阴性患者随访期间只有3例复发。

　　讨论

　　我们采用RT-PCR方法检测了急性白血病患者骨髓细胞cyclin D₁ mRNA，5名正常骨髓均未见阳性表达和Withers等[6]的研究结果一致。65例急性白血病患者中总的cyclinD1mRNA阳性表达率为26.2％，ANLL和ALL患者的阳性率差异无显著性。我们把患者分成初治组、复发组及缓解组，研究发现复发患者的cyclin D₁ mRNA阳性率明显高于初治及缓解期的患者，cyclin D₁ mRNA阳性患者的复发比例（41.2％）也明显高于cyclin D₁ mRNA阴性患者（8.3％）。可能cyclin D₁过度表达，改变了细胞周期进程，缩短了G1期，从而促使细胞增殖，对白血病的复发有一定的作用。本组实验中，初治患者比缓解期患者的阳性率高，也进一步说明过度表达cyclin D₁的细胞是原始及幼稚细胞。有人研究发现cyclin D₁的表达能够被活化的myc和ras癌基因所诱导，故而认为cyclin D₁也有一定的致癌性。没有染色体易位的急性白血病患者中也有cyclin D₁ mRNA的过度表达，其机制可能是在某些情况下，cyclin D₁ mRNA由于某种原因在3′端被截断而失去了一段AUUUA序列，此序列常常能使mRNA的半衰期缩短，被截断的转录子比正常转录子要更稳定，故而也造成了cyclin D₁ mRNA的过度表达。除了截断以外，人们在研究过度表达的cyclin D₁转录子中并未发现有突变的情况。

　　参考文献：

　　1　Jiang W, Kahn SM, Tonita N, et al. Amplification and expression of the human cyclin D gene in esophageal cancer. Cancer Res, 1992, 52:2980-2983.

　　2　Gillett C, Fantl V, Smith R, et al. Amplification and overexpression of cyclin D1 in breast cancer detected by immunohistochemical staining. Cancer Res, 1994, 54:1812-1817.

　　3　Zhang YJ, Jiang W, Chen CJ, et al. Amplification and overexpression of cyclin D1 in human hepatocellular carcinoma. Biochem Biophys Res Commun, 1993, 196:1010-1016.

　　4ansange S, Gansange F, Ramadani M, et al. Overexpression of cyclin D1 in human pancreatic carcinoma is associated with poor prognosis. Cancer Res, 1997, 57:1634-1637.

　　5　Inoue K, Sugiyama H, Ogawa H, et al. WT1 as a new prognostic factor and a new marker for detection of minimal residual disease in acute leukemia. Blood, 1994, 84:3071-3079.

　　6　Withers DA, Harvey RC, Faust JB, et al. Characterization of a candidate bcl-1 gene. Mol Cell Biol, 1991, 11:4846-4853.

收稿：1998-08-10修回：1999-01-25

校对：张吉贤