不同病期白血病骨髓细胞端粒酶活性的检测

中华血液学杂志 1999年第11期第20卷 研究报告

作者：陈晓　王冠军　李薇　张福明　易永林

单位：130021　长春，白求恩医科大学第一临床学院血液肿瘤科

　　端粒是真核生物染色体末端的一种特殊结构，由一富含鸟嘌呤的重复DNA序列及其相关蛋白组成^［1，2］。端粒是保护染色体末端稳定必不可少的结构。端粒长度的维持需要端粒酶活性的存在^［3］。永生细胞和肿瘤细胞能够长期生存，端粒酶起到了重要的作用。我们用端粒重复扩增银染法检测了原代白血病细胞和白血病细胞系的端粒酶活性，以研究端粒酶活性在急性白血病不同病期和被诱导分化的白血病细胞系中的改变，初步探讨端粒酶活性的调节机制及其在急性白血病中的临床意义。

　　材料和方法

　　1　细胞来源　HL-60细胞株来自本校预防医学院放射生物教研室。骨髓细胞来自近期本院住院的白血病患者和骨髓象完全正常的非血液病患者。急性白血病患者34例，男19例，女15例，其中M₁型2例，M₂型2例，M₃型14例，M₄型5例，M₅型　5例，ALL型6例。急性期（初发患者，未经任何治疗）20例，首次缓解期（首次治疗2个疗程以内达完全缓解）6例，持续缓解6个月以上者4例，复发4例。非血液病患者10例，其中风湿性疾病患者5例，败血症患者2例，正常人3名。年龄20～65岁，中位年龄36岁。

　　2　试剂　端粒酶活性检测试剂盒购自军事医学科学院。

　　3　实验方法

　　3.1　骨髓细胞的处理：肝素抗凝的骨髓8～10 ml，常规密度梯度离心，分离单个核细胞，取细胞总数为1×10⁶，白血病急性期患者的标本经涂片证实白血病细胞＞70％，标本以常规方法经程序冷冻仪冷冻后，置于液氮中保存待检。

　　3.2　全反式维甲酸体外诱导HL-60细胞：取生长良好的HL-60细胞分别同终浓度为10^-5mol/L、10^-6mol/L、10^-7mol/L全反式维甲酸培养0，2，4，6天后收集细胞，以台盼蓝染色，计数活细胞所占百分率，洗涤取活细胞总数为1×10⁶个，同上述方法冷冻保存。同时做硝基蓝四氮唑（NBT）还原实验，离心涂片，瑞-吉染色，计数200个细胞中的阳性细胞数。另取培养后的细胞，进行细胞涂片，瑞氏染色，显微镜下观察诱导分化后的细胞形态改变，计数200个细胞并进行细胞分类，取分化最明显的一组细胞，进行端粒酶活性的检测。

　　3.3　检测端粒酶活性：从液氮中取出冻存的细胞，立即加裂解液100 μl，冰浴30分钟，4 ℃　16 000×g离心30分钟，取上清备用。将标本置65 ℃灭活5分钟作为阴性对照。阳性对照由试剂盒提供。在反应管中加入以下组分：TRAP反应液25 μl，Taq酶0.2 μl，提取液1 μl，混匀，37 ℃保温30分钟后，加入反向引物5 μl，混匀，按以下条件进行扩增：94 变性30秒，55 ℃退火30秒，72 ℃延伸30秒，循环30次，72 ℃延伸10分钟。在反应管中加入5 μl 6×上样缓冲液，混匀，取30 μl于120 g/L聚丙烯酰胺凝胶、1×TBE条件下电泳，硝酸银染色，阳性结果可见相隔6个核苷酸的梯形条带，照相，以Photoshop软件对条带进行辉度分析，以条带的辉度值代表端粒酶的活性。

　　4　统计分析　以t检验对结果进行统计学处理。

　　结　果

　　1　急性期白血病患者骨髓细胞端粒酶活性检测结果见表1和图1。在急性白血病不同时期，即发病初期和首次缓解期，端粒酶活性无明显差异（P＞0.05），经巩固治疗缓解期长于6个月的患者，骨髓细胞端粒酶活性与发病初期相比明显降低（P＜0.05），白血病复发期骨髓细胞的端粒酶活性与发病初期相比，差异无显著性（P＞0.05）。急性白血病各个时期的骨髓细胞的端粒酶活性均明显高于正常骨髓细胞（P＜0.001）。

表1　急性白血病不同病期骨髓细胞的端粒酶活性(辉度值,例数=3)

1:阳性对照；3：阴性对照；2，4～8：急性白血病急性期患者

1　急性白血病急性期患者骨髓细胞端粒酶活性检测结果

　　2　不同浓度维甲酸作用于HL-60细胞第2，4，6天时，NBT反应阳性细胞率均明显高于对照组，且差异具有显著性（P＜0.01）。各剂量组之间，在相应时间点上均以10^-6组阳性率最高，差异具有显著性（P＜0.01），其阳性率分别为49%，84%，97% 。从形态上观察，随着维甲酸作用时间的延长，HL-60细胞逐渐分化为中幼粒、晚幼粒，直至成为成熟细胞。对细胞进行分类计数，发现10^-6组细胞分化最明显，与NBT还原试验结果一致。对10^-6组细胞进行端粒酶活性的检测，结果为随着细胞的分化，其端粒酶活性也随之下降，与对照组相比其活性分别下降了33%，65%，100%。

　　讨　论

　　90年代Kim等^［4］建立了端粒重复扩增法，大大提高了检测端粒酶活性的灵敏度。人们已经在胃癌、前列腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中检测到了端粒酶活性，证明肿瘤的发生与端粒酶的激活有密切的联系，端粒酶被认为是新的肿瘤标记物并可能成为肿瘤治疗的新靶点。

　　急性白血病各个时期的骨髓细胞的端粒酶活性均明显高于正常骨髓，说明端粒酶的激活在白血病的形成和发展过程中起着重要的作用。在急性白血病治疗的各个阶段，表现出不同的端粒酶活性，提示我们是否可以将端粒酶活性作为判定白血病预后和预示早期复发的指标。另外，端粒酶活性检测是否可以作为监测白血病前期病变和骨髓增生异常综合征及其它骨髓增殖性疾病向急性白血病转化的指标，也是值得进一步探讨的问题。

　　全反式维甲酸，可以诱导多种肿瘤细胞分化并逆转其恶性表型^［5］。我们发现维甲酸诱导HL-60细胞分化的过程中，随着细胞的分化，其端粒酶活性持续下降。一般认为具有增殖能力的细胞有三种可能的去向：①长期处于G₀期，保持稳定状态；②启动增殖程序，进行增殖；③进入分化阶段，成为更成熟的细胞，直至成为终末细胞。维甲酸是通过与细胞受体结合而启动细胞的分化过程^［6］，而端粒酶是保持细胞增殖的因素。若维甲酸使细胞分化，那必然首先或同时阻断细胞增殖，维甲酸通过哪一种机制阻断早幼粒细胞的增殖，是否与抑制端粒酶活性有关，值得我们进一步研究。

　　端粒酶与肿瘤发生存在明确的相关性，把端粒酶作为肿瘤治疗的新靶点的研究也已广泛开展。我们的研究结果表明，细胞被诱导分化的同时，端粒酶的活性也随之降低，为恶性肿瘤的治疗又提供了新的思路。

　　参考文献

　　1　Forney J, Henderson ER, Blackburn EH，et al. Identification of the telomeric sequence of the acellular slime molds didymium iridis and physarum polycephalum. Nucleic Acids Res,1987,15:9143-9152.

　　2　Moyzis RK,Buckingham JM,Cram IS,et al.A highly conserved repetitive DNA sequence,(TTAGGG)n,present at the telomeres of human chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A,1988,85:6622-6628.

　　3　Blackburn EH.Telomerases.Annu Rev Biochem,1992,61：113-129.

　　4　Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science,1994,266:2011-2015.

　　5　曹世龙，主编. 肿瘤学新理论与新技术.上海：上海科技教育出版社，1997. 663-665.

　　6　方圻，主编. 现代内科学（下卷）. 北京：人民军医出版社，1996.2224.

收稿：1998-11-02　　修回：1999-07-05