p16基因异常与慢性粒细胞白血病关系的研究

中华血液学杂志 1999年第11期第20卷 研究报告

作者：许多荣　洪文德　童秀珍　彭爱华　罗绍凯

单位：510080　广州，中山医科大学附属第一医院血液科

　　我们采用半定量多重聚合酶链反应(PCR)和PCR-单链构象多态性(SSCP)检测了48例慢性粒细胞白血病(CML)患者p16基因纯合缺失和点突变，以期从分子生物学水平探讨p16基因分子生物学异常与CML的关系。

　　对象和方法

　　1　对象　12名正常人，男性7名，女性5名，平均年龄31.6岁。48例CML患者,其中慢性期20例，急粒变16例，急淋变12例(所有病例原始淋巴细胞+幼稚淋巴细胞≥0.20，组织化学染色都表现为糖原染色过碘酸反应强阳性，POX阴性),男性33例，女性15例,平均年龄33.6岁。K562细胞株为p16基因纯合缺失，作为p16基因缺失的阳性对照。凝血因子Ⅸ外显子4(E4)为内对照。引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成，其序列见表1。

表1　不同基因外显子的引物序列

　　 2　方法

　　2.1　DNA提取：取骨髓或外周血5 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液离心收集单个核细胞(MNC)，常规方法提取DNA，并进行浓度和纯度测定。

　　2.2　半定量多重PCR检测p16基因纯合缺失：将E1或E2和E4放在一个体系中进行多重PCR扩增。反应总体积50 μl，含1.5 U DNA聚合酶，DNA 200 ng，E1、E2、E4引物量分别为25 pmol、25 pmol、50 pmol。PCR循环条件：E1+E4： 94 ℃ 1分钟，58 ℃ 1分钟，72 ℃ 1.5分钟；E2+E4： 94 ℃ 1分钟，56 ℃ 1分钟，72 ℃ 1.5分钟，两者均为35个循环，DNA扩增产物先经20 g/L琼脂糖电泳、紫外灯下照相，负片再送TCL薄层扫描仪扫描，测出两条产物带的吸光度(A)值，计算比值。正常人应扩增出两条带，第1条为内对照凝血因子Ⅸ基因E4扩增产物，其长度为273 bp，第2条带为p16基因E1或E2扩增产物，长度为336 bp或393 bp。其比值用即A₁/A₄或A₂/A₄(A₁、A₂、A₄分别代表p16基因E1、p16基因E2、凝血因子Ⅸ基因E4扩增产物吸光度扫描值)表示。再以3倍K562细胞DNA和1倍正常人细胞DNA多次混合扩增的比值的平均值(₁=A₁/A₂,₂=A₂/A₄)作为p16基因纯合缺失的标准值，本实验测得的₁=1.1716±0.0913、₂=1.1680±0.0841。其判断方法参考Sill等方法^［1］。如患者的基因扩增后测得的A₁／A₄（A₂／A₄）小于₁（₂)，则可认为此例患者属p16基因E1(E2)纯合缺失。

　　2.3　p16基因E1和E2 PCR-SSCP分析：先进行p16基因单个外显子PCR扩增，反应总体积50 μl，含1.5 U Taq DNA酶，DNA 200 ng,E1、E2引物量均为25 pmol。PCR循环条件：E1：94 ℃ 1分钟，58 ℃ 1分钟，72 ℃ 1.5分钟；E2：94 ℃ 1分钟，56 ℃ 1分钟，72℃ 1.5分钟，两者均35个循环，开始97 ℃变性8分钟，结尾72 ℃延伸5分钟。扩增后产物经聚丙烯酰胺垂直电泳、银染，观察电泳带变化，确定有无异常发生。

　　3　统计学分析　采用四格表χ²检验和四格表确切概率计算法。结　果

　　1　正常人和CML患者p16基因纯合缺失的检测结果(见图1)　12名正常人均无p16基因E1和E2纯合缺失。48例CML患者共有9例发生缺失，且E1和E2同时发生缺失。

　　M：分子量标准；1～9：9例CML患者

1　9例CML患者p16基因E2多重PCR扩增产物电泳图

　　如图1所示，扩增产物中出现两条带，第1条带为Ⅸ因子基因E4扩增产物，其长度为273 bp，第2条带为p16基因E2扩增产物，其长度为393 bp。例2、例3、例9的A₁/As(A₂/As)比值小于₁(₂)，则可认为这3例患者属p16基因E2纯合缺失。

　　2　CML患者p16基因点突变的检测　对12名正常人和39例CML患者(48例除外9例p16基因纯合缺失)进行PCR-SSCP分析，结果均未发现有点突变发生。部分病例SSCP分析见图2。

　　M:分子量标准；N₁、N₂：正常人

2　部分CML患者p16基因PCR-SSCP电泳图

　　讨　论

　　本组48例CML患者中，只有急淋变组与正常人组比较p16基因纯合缺失差异显著，而慢性期组和急粒变组与正常人比较差异均无显著性。Ogawa等^［2］报道CML慢性期p16基因纯合缺失率也很低，Sill等^［1］发现50%的急性淋巴细胞白血病患者有p16基因纯合缺失，Serra等^［3］在17例急性期CML病例中，检出3例有p16基因纯合缺失，且3例均为急淋变病例。这些结果提示p16基因纯合缺失与CML发生及急粒变关系不大，但与CML急淋变存在着密切的关系。实验中我们还发现，在8例急淋变p16基因纯合缺失病例中，有3例是在急变前就已发生p16基因纯合缺失，最早的1例发生在急变前3个月。p16基因纯合缺失与CML急淋变关系密切，其机制尚不清楚。目前认为，淋巴细胞内存在着某些特殊机制(如DNA重组酶活性增高)，如果p16基因发生纯合缺失，细胞内缺乏p16蛋白竞争的CDK活性就增强，从而淋巴细胞性肿瘤增殖加快，而粒系肿瘤细胞增殖减慢，在细胞永生化的过程中淋巴细胞性肿瘤获得优势，最终演变为急淋变。我们在12名正常人和39例CML患者中未发现有p16基因点突变，Ogawa等^［2］也报道p16基因点突变在CML中很少发生。

　　总之，CML p16基因点突变是一个较低概率的事件，其分子生物学异常主要是p16基因纯合缺失。临床上，利用部分CML患者在急淋变前就已发生p16基因纯合缺失这一特点，检测p16基因纯合缺失就可预测部分CML患者发生急淋变，就可在急淋变前及时采取有效治疗措施如强烈联合化疗或骨髓移植，以提高治愈率。

　　参考文献

　　1　Sill H, Goldman JM, Cross NC, et al. Homozygous deletions of the p16 tumor suppressor gene are associated with lymphoid transformation of chronic myeloid leukemia. Blood, 1995, 85:2013-2016.

　　2　Ogawa S, Hangaishi A, Miyawaki S, et al. Loss of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor (p16, MTS1) gene is frequent in and highly　specific to lymphoid tumors in primary haematopoietic malignancies. Blood, 1994, 84:3122-3126.

　　3　Serra A, Gottardi E, Della F, et al. Involvement of the cyclin dependent kinase-4 inhibitor (CDKN2) gene in the pathogenosis of lymphoid blast crisis of chronic myelogenous leukemia. Br J Haematol, 1995, 91:625-629.

收稿：1998-08-12　　修回：1999-05-28