眼镜蛇毒M组分对白血病细胞株的毒性作用
中华血液学杂志 1999年第11期第20卷 研究报告
作者：谭获 余清声 应红光 齐静
单位：谭 获 510260 广州医学院第二附属医院；余清声 广州医学院蛇毒研究所；应红光 齐 静 中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所
眼镜蛇毒M组分（fraction M from naja naja atra venom, FMNNAV）主要成分为膜毒素，研究证明FMNNAV有多种作用。我们探讨了FMNNAV在体外对敏感及耐药白血病细胞株的毒性作用及与阿霉素（ADM）的协同抗肿瘤效应。
材料和方法
1 药物及试剂 FMNNAV（0.2 mg/支,批号970501）为广州蛇毒研究所产品;ADM为深圳万乐药业有限公司产品;MTT及碘化丙锭（PI）为 Sigma公司产品。上述药品均以无菌生理盐水配成相应浓度备用。二甲基亚砜(DMSO)为天津市化学试剂一厂产品；RPMI 1640为美国Gibco公司产品。
2 细胞系 K562/S（敏感株）和K562/A02（耐药株）由中国医学科学院血液学研究所药物室提供，MCF-7/R为人乳腺癌细胞耐药株，由中国医学科学院肿瘤研究所提供，K562/A02与MCF-7/R均具有多药耐药(MDR)表型。
3 主要仪器 Titertek Multiscan 酶标仪；EPICS-CS流式细胞仪（美国Coulter公司产品）。
4 FMNNAV细胞毒实验 采用MTT法：取对数生长期细胞，接种于灭菌的96孔培养板中，每孔160 μl，含细胞数2×104，每孔有含体积分数为10%的新生牛血清的RPMI 1640培养液，在37 ℃、体积分数5%的CO2、饱和湿度条件下培养12小时后实验组加不同浓度FMNNAV 40 μl，对照组加等体积的生理盐水，使每孔终体积为200 μl。每种药物浓度均设3个平行孔。68小时后各孔加MTT 20 μl（5 mg/ml），继续在前述条件下培养4小时后2 000 r/min离心10分钟，弃上清。加入DMSO 150 μl，振荡至MTT完全溶解，用酶标仪检测546 nm波长下各孔的吸光度（A）值，取3孔平均数，按下式计算药物对细胞生长的抑制率（%）：
5 FMNNAV对ADM细胞毒性的影响
5.1 ADM IC50的计算：K562/S细胞组使用的ADM浓度为12.500，6.250，3.125，1.562，0.781，0.390，0.195 μg/ml，IC50=(2.83±0.08)μmol/L。K562/A02组和MCF-7/R组为100.000，50.000，25.000，12.500，6.250，3.125 μg/ml，IC50分别为(158.35±49.22)μmol/L和(196.55±56.21)μmol/L。
5.2 FMNNAV对ADM细胞毒性的影响：分别取浓度为0.05，0.10，0.20 μg/ml的FMNNAV加入“5.1”项各浓度ADM中，计算IC50。
6 细胞凋亡检测 采用流式细胞仪，按文献［1］方法：PI染色后测定亚二倍体（0.2C-1.6C）作为凋亡细胞数，FLSX90LS设立电子门，以除去细胞碎片。
7 统计学方法 数据以
±s表示，采用t检验。
结 果
1 FMNNAV对K562细胞的毒性作用 如图1所示，FMNNAV对K562/S、K562/A02均有明显的毒性作用，杀伤强度相近，IC50分别为1.86和2.26 μg/ml(两者间比较，P＞0.05); FMNNAV对敏感和耐药细胞的毒性随浓度增高而增强,呈现良好的量效关系(r值分别为0.88, 0.82)。
1 FMNNAV对耐药和敏感K562细胞株的毒性作用
2 FMNNAV对ADM细胞毒性的影响 不同浓度的FMNNAV能不同程度地增强ADM对K562/S、K562/A02细胞的杀伤作用，表现为IC50下降（表1），说明FMNNAV对ADM杀伤K562/S和K562/A02细胞具有较好的协同作用。
表1 FMNNAV对ADM细胞毒性的影响
| 组别 |
IC50(μmol/L,±s) |
| K562/S |
K562/A02 |
MCF-7/R |
| ADM |
2.83±0.08 |
196.55±56.21 |
158.35±49.32 |
| ADM+FMNNAV |
2.00±0.01 |
138.31±14.35 |
156.23±50.12 |
| (0.05 μg/ml) |
| ADM+FMNNAV |
1.73±0.35* |
129.23±13.25* |
160.53±43.36 |
| (0.10 μg/ml) |
| ADM+FMNNAV |
1.48±0.02* |
120.98±12.52* |
161.11±52.22 |
| (0.20 μg/ml) |
注：与单纯ADM组比较，*P＜0.01
3 FMNNAV对K562细胞凋亡的影响 将FMNNAV与K562/S细胞混合培养24小时（FMNNAV终浓度为25 μg/ml）后，在流式细胞仪上测定凋亡细胞的百分率，结果对照组为2.20%，蛇毒组为40.52%，两组间比较，差异有显著性（P＜0.01）。
讨 论
近年来，国内外对蛇毒抗肿瘤作用的研究日趋重视［2］。各类蛇毒中，眼镜蛇蛇毒的直接抗癌效应最强［3］。研究表明，膜毒素是其抗肿瘤作用的主要有效成分［4］。眼镜蛇蛇毒具有较广的抗肿瘤谱，其中对白血病细胞的杀伤最为明显［5］。
我们应用FMNNAV直接作用于K562/S、K562/A02细胞株，发现FMNNAV无论对药物敏感株还是耐药株均有相近的、强烈的细胞毒作用（IC50分别为1.86和2.26 μg/ml）,且呈良好的量效关系(r值分别为0.88和0.82),提示FMNNAV对K562细胞株的杀伤作用不受MDR发生的影响, 为临床开发利用蛇毒来治疗耐药的白血病提供了一个新线索。
我们观察了加用FMNNAV后ADM的IC50变化及ADM联合FMNNAV后细胞抑制率的变化。结果显示，FMNNAV能增加ADM对K562/S、K562/A02杀伤的敏感性，两种药物具有协同效应，为临床联合用药、减少单药剂量、提高疗效提供了实验依据。
关于蛇毒抗癌的机制，目前认为主要是膜毒素能通过肿瘤细胞膜特定的结合部位而损害其结构和功能，导致细胞溶解、破坏；在此过程中，同时增加了抗癌药物的透膜作用，从而提高了化疗效果，与化疗药物联用时产生协同作用。我们的初步研究显示眼镜蛇毒尚能诱导白血病细胞的凋亡。
志谢：本工作承郝玉书、杨纯正二位教授指导，特此致谢
参考文献
1 宋平根，李素文,主编.流式细胞术的原理和应用.北京：北京师范大学出版社，1992. 55-56.
2 张于平.国内20年蛇毒与肿瘤文献分析.蛇志，1998，10：20-22.
3 赵蓉，游云，高敏新，等.蛇毒对人及小鼠传代细胞的杀伤作用.福建医学院学报，1988，3：204-206.
4 Gasanov SE, Alsarraj MA, Gasanov NE, et al. Cobra venom cytotoxin free of phospholipase A2 and its effect on model membranes and T leukemia cells. J Membr Biol,1997,155:133-142.
5 杨惠玲，郭禹标.蛇毒膜毒素抗肿瘤作用的研究进展.癌症，1996，1：72-73.
收稿：1998-11-19 修回：1999-04-19
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