反义c-myc基因抗L6565白血病作用的研究
中华血液学杂志 1999年第12期第20卷 研究报告
作者:赵新永 殷莲华 孔宪寿 杨轶群
单位:200032 上海医科大学病理生理学教研室
小鼠L6565白血病是我国特有的T-S-Z实验性白血病/淋巴瘤系统中的实验动物模型之一[1]。我室用L6565白血病小鼠的脾脏细胞悬液以有限稀释法建立了L6565细胞株,在对其早期癌基因进行筛选时,发现c-myc基因过度表达,这提示c-myc的高表达可能与L6565白血病的发生机制有关[2]。为了进一步探索c-myc与L6565白血病发病机制的关系及反义c-myc对其治疗作用,我们针对高表达的c-myc构建了一个含有反义c-myc基因的逆转录病毒载体,观察它对L6565白血病细胞株恶性表型和恶性行为的影响。
材料和方法
1 细胞株和主要试剂 L6565白血病细胞株是本教研室建立的克隆细胞株,PA317包装细胞系、NIH/3T3细胞系均由ATCC提供。各种工具酶及c-myc单抗购自Promega公司,G418、Polybrene、MTT购自Sigma公司,ABC试剂盒购自华美生物工程公司,磷酸钙-DNA转染试剂盒和dNTP购自Pharmacia公司。
2 载体构建 逆转录病毒载体PGNC、pSVcmycl(在BamHI-Xbal位点插入了小鼠c-myc基因,含有外显子2和3,插入片段长4.8 kb)购于ATCC。将构建好的含有反义c-myc载体和空载体命名为PGNCas和PGNCneo。
3 DNA转染 采用DNA-磷酸钙共沉淀法分别将PGNC和PGNCas DNA转移入PA317细胞中,用G418进行筛选得到阳性克隆细胞PA317/PGNCneo和PA317/PGNCas。将这两种细胞以5×105/ml培养24小时,收集上清,3 500×g离心10分钟,吸取上清测病毒效价。
4 细胞培养 PA317、NIH/3T3细胞均用含体积分数为10%小牛血清的DMEM培养液培养,用1.25 g/L胰蛋白酶液消化。L6565细胞用含体积分数为10%小牛血清的RPMI 1640培养液培养,置于37 ℃,体积分数为5%的CO2培养箱内水平式培养。将得到的病毒PGNCneo和PGNCas分别感染L6565细胞,经G418筛选,分别得到L6565neo和L6565as细胞。用L6565和L6565neo细胞作对照。
5 形态学观察 显微镜下观察L6565as细胞和对照组细胞的生长情况,并作显微摄片。
6 细胞生长曲线的绘制 用MTT法,参照试剂盒说明进行。
7 流式细胞仪分析细胞周期 取2×106细胞用PBS洗后,加1.8 ml胰酶消化液在37 ℃消化数分钟,再加1.5 ml胰
本课题受上海市教委高校科技发展基金(97JG05053)资助
酶抑制液终止胰酶消化,加1.5 ml碘化丙锭染色15分钟,每一标本取1×104细胞进行分析。
8 软琼脂集落形成实验参照文献[3]进行。
9 免疫组织化学检测c-myc蛋白 采用常规ABC法。
结 果
1 c-myc蛋白检测 L6565细胞和L6565neo细胞c-myc蛋白表达为强阳性,而L6565as细胞为弱阳性,其免疫组织化学灰度扫描值分别为10 029.33±355.13,10 701.20±583.36和3 043.28±599.28,经统计学分析差异有显著性。
2 形态学观察 L6565neo和L6565细胞形态差别不大,细胞密集生长,呈圆形或类圆形,高倍镜下细胞大小差异悬殊,L6565as细胞大小较一致,呈圆形。
3 反义c-myc对L6565细胞生长的影响 结果见图1,从生长曲线看,L6565as细胞与L6565、L6565neo细胞相比,生长速度明显减慢。
1 L6565、L6565neo和L6565as细胞生长曲线(MTT法)
4 细胞周期检测 流式细胞仪分析结果表明,反义c-myc基因阻碍了L6565细胞进入S期,使细胞阻滞于G0/G1期,与对照组相比,其G0/G1期细胞明显增加,而S期细胞相对减少,结果见表1。
表1 反义c-myc对L6565细胞周期的影响(±s)
细胞 |
样本数 |
G1(%) |
S(%) |
G+M(%) |
L6565 |
3 |
26.1±4.2 |
56.2±3.2 |
17.6±5.4 |
L6565neo |
3 |
30.7±5.0 |
38.9±6.3 |
30.4±6.2 |
L6565as |
3 |
46.0±4.6 |
31.3±2.3 |
22.7±4.6 |
5 软琼脂集落形成能力 L6565as细胞的软琼脂集落形成能力与对照组细胞相比显著降低。L6565、L6565neo和L6565as的集落数分别为(27.3±3.1)/2×106细胞、(28.7±2.5)/2×106细胞和(9.0±2.8)/2×106细胞(两两比较,P值均<0.01)。讨 论
我们将构建的反义c-myc基因导入L6565白血病克隆细胞,导入反义c-myc基因的L6565细胞的c-myc蛋白显著下降,而对照细胞c-myc蛋白表达依然呈强阳性,表明反义RNA抑制了c-myc的表达。c-myc蛋白的下降可能是由两方面因素引起的:一方面是因为反义RNA和mRNA结合导致mRNA不能翻译;另一方面是因为反义RNA负性调控c-myc的转录。c-myc蛋白的下降,也说明了我们构建的反义c-myc基因在细胞内确实得到了高效表达。
导入反义c-myc基因的L6565细胞与对照细胞相比,表现为:①细胞形态变圆,大小变得较均一;②细胞生长速度降低;③细胞在体外软琼脂中集落形成减少;④细胞周期检测发现细胞阻滞于G0/G1期。结果表明反义c-myc确实对L6565白血病细胞有抑制作用,并且可能还有部分促分化作用,使L6565白血病细胞向正常细胞的成熟阶段分化,细胞恶性程度降低,这与严开平等[4]用反义寡核苷酸抑制SACⅡB2细胞(与L6565细胞属于同一系统的淋巴瘤细胞株)中高表达的c-fos基因时,细胞分化时的形态变化一致。可以初步认为,这种细胞形态变化是由于细胞向成熟阶段分化所导致的。从生长曲线上发现在第5天对照细胞和L6565neo细胞生长曲线呈下降趋势,而L6565as细胞的生长基本上仍呈上升趋势,产生这种情况的可能原因是L6565细胞生长过快,在第4天生长达到最高峰,以后由于细胞过多,营养不足,以致细胞大量死亡。而L6565as细胞生长缓慢,细胞数量较少,可获得足够的空间和营养而继续生长,故死亡率低。
细胞周期检测表明,L6565as细胞和对照细胞相比细胞被阻滞于G0/G1期。一般认为细胞增殖的速度主要与G1期的长短有关,阻滞细胞从G1期进入S期就可抑制细胞增殖。现在已经证明c-myc基因的产物为细胞从G1期进入S期所必须,抑制c-myc就可抑制细胞从G1期进入S期,从而抑制肿瘤细胞的快速增殖。本实验结果也验证了这一点。我们发现L6565neo细胞的周期分布和L6565细胞相比有所不同,导致这种情况的原因不清楚。
参考文献
1 程立. 实验性T-S-Z白血病系统的研究(1980-1986). 自然杂志,1987,10:937.
2 殷莲华,郑颂国,程立. L6565小鼠白血病癌基因表达的初步研究. 中国病理生理杂志,1997,13:173-175.
3 邓平,程立,孔宪寿. 维生素A酸诱导分化小鼠淋巴细胞白血病/淋巴瘤的实验研究. 实验肿瘤学杂志,1990,4:1.
4 严开平,殷莲华,郑颂国,等. 反义c-fos寡脱氧核苷酸对淋巴瘤细胞株SACⅡB2恶性表型抑制的研究. 中国肿瘤生物治疗杂志,1997,4:58-60.
收稿:1998-07-15 修回:1999-04-15