热休克体外诱导自身T细胞对慢性髓系白血病细胞的杀伤

中华血液学杂志 2000年第6期第21卷 论著

作者：何学鹏　尤胜国　卞寿庚　廖晓龙　李牧　马双　葛薇　钱林生

单位：300020　天津，中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院

关键词：白血病，髓细胞性，慢性；T淋巴细胞；热休克；热休克蛋白70

　　【摘要】　目的　研究热休克对慢性髓系白血病（CML）患者自身T细胞杀伤(ATK)肿瘤细胞活性的影响。方法　用⁵¹Cr释放法检测自身T细胞对热休克处理的CML靶细胞(ΔCML)和未热休克处理的CML靶细胞（δCML）的ATK活性；用流式细胞仪检测CML细胞热休克蛋白70(HSP70)的表达；淋巴细胞混合培养(MLTC)法刺激扩增T细胞，并检测其免疫表型和ATK活性。结果　21例CML患者中有4例显示对δCML有ATK活性，有10例对ΔCML有ATK活性。IL-2刺激的自身T细胞对tCML的ATK活性为(20.37±10.72)%，不仅高于对δCML的ATK活性［（7.42±6.49）%，P＜0.01］，也明显高于未刺激的自身T细胞对δCML的ATK活性［（1.51±3.42）%，P＜0.001］。δCML和ΔCML胞浆HSP70的表达差异无显著性，未检测到细胞膜HSP70表达增加。MLTC扩增的自身T细胞表型为TCRγδ-CD₃，以CD₈⁺ T细胞为主，部分细胞表达CD₂₅和HLA-DR，γδ T细胞仅占（0.33±0.24）%；其对ΔCML和δCML的ATK活性分别为（51.25±4.26）%和（36.52±3.83）%，而对K562细胞杀伤活性仅为（2.92±1.19）%。结论　热休克可诱导或促进自身T细胞，尤其是IL-2刺激的T细胞的ATK活性，热休克诱导的ATK活性似与γδ T细胞或CML细胞膜HSP70表达无关。

In vitro induction of autologous T cell killing by heat treated human chronic myelogenous leukemia cells

HE Xuepeng，YOU Shengguo，BIAN Shougeng，et al.

　　(Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital，CAMS and PUMC.，Tianjin　300020，China)

　　【Abstract】　Objective　To investigate the potential of autologous T cell killing of heat treated chronic myelogenous leukemia (CML) cells (autologous tumor killing, ATK). Methods　⁵¹Cr release assay was used to measure the ATK activity of autologous T cells against CML cells treated with 42℃ for 30 minutes (heat) or 37℃ for 30 minutes (non-heat). The phenotypes of T cells and heat shock protein 70(HSP70) expression of CML cells were measured by flow cytometry (FCM). T cells from the CML patients were stimulated and expanded by autologous mixed lymphocyte/tumor cells cultures (MLTC). Results　ATK activity of autologous T cells to the non-heated and heated CML cells were found in 4 (19.05%) and 10 (47.62%) of the 21 cases, respectively. The ATK activity of interleukin-2 (IL-2) stimulated autologous T cells against heated CML cells was markedly higher than that of unstimulated autologous T cells against non-heated CML cells (P＜0.001). FCM analysis showed that no HSP70 was expressed on the CML cell membranes whether heated or non-heated, but intracellular HSP70 expressions were (83.42±5.65)% and (78.34±6.32)% pre and post-heated, respectively. The phenotypes of T cells stimulated and expanded in MLTC were TCRγδ- CD₃⁺, mostly CD₈⁺, with some activation markers (CD₂₅ and HLA-DR) expression.The ATK activities of these T cells against the heated and non-heated CML cells and K562 cells were （51.25±4.26）%, (36.52±3.83）% and （2.92±1.19）%,respectively. Conclusions　 ATK activity of autologous T cells against CML cells could be induced or enhanced by heat treatment of the CML cells. particularly of T cells stimulated with IL-2. This ATK activity was not associated with γδ T cells or HSP70 expression of CML cells.

　　【Key words】　Leukemia, myelogenous, chronic;　T lymphocytes;　Heat shock;　Heat shock protein 70

　　慢性髓系白血病（CML）细胞表达的P210^bcr-abl是HLA限制性的、可被T细胞识别的肿瘤特异性抗原；输注供者淋巴细胞可诱导异基因干细胞移植后复发的CML患者获得再次缓解，因此CML是进行免疫治疗研究的对象^［1］。我们以往的工作证明慢性期CML患者骨髓中NK和T细胞功能异常是可逆的，CML患者体内存在对自身白血病细胞的特异免疫反应^［2］。热休克蛋白70（HSP70）是γδT细胞的识别配体，诱导肿瘤细胞表达HSP70可增强T细胞（主要是γδT细胞）的杀伤活性^［3］。为探讨CML的免疫治疗，我们研究了热休克（42℃孵育30min)促进自身T细胞对CML细胞杀伤（ATK）活性及其与热休克诱导CML细胞HSP70的表达和γδT细胞之间的相关性。

材料和方法

　　1　标本　本研究包括21例初诊未治患者，根据临床症状和体征、血象、骨髓象、细胞化学和细胞遗传学检查结果确诊为CML慢性期；其中男15例，女6例，中位年龄31（4～67)岁。用Ficoll液（相对密度1.077）分离骨髓单个核细胞，再用40g/L AET处理的羊红细胞分离获得T细胞和去除T细胞的骨髓单个核细胞（CML靶细胞）。一部分CML靶细胞立即用于实验，大部分细胞用液氮冻存备用。

　　2　细胞株　K562细胞系来自本所细胞培养室，完全培养液（CM）常规培养，CM为RMPI 1640液中含体积分数为10%的小牛血清、25mmol/L Hepes、2mmol/L L-谷胺酰胺、1×10⁵U/L 青霉素、100mg/L 链霉素、0.05mmol/L 2-巯基乙醇。

　　3　试剂　CD₃、CD₄、CD₈、CD₁₄、CD₁₅、CD₁₉、CD₅₆、CD₂₅和HLA-DR单克隆抗体（单抗）以及FITC标记的兔抗鼠二抗购自本所免疫室，抗全部 γδT细胞的单抗TCRγδ 和抗HSP70单抗分别购自PharMingen和Coulter公司，皂苷购自Sigma公司。白细胞介素2（IL-2）购自军事医学科学院，比活性为2×10⁶U/mg。

　　4　靶细胞的热休克处理　未标记和标记⁵¹Cr的CML靶细胞（2×10⁵/ml）42℃孵育30min进行热休克，对照标本37℃孵育30min，上述处理后再经37℃、体积分数为5%的CO₂孵育2h（文中以CML表示热休克的CML靶细胞，δCML表示未热休克的CML靶细胞）。

　　5　IL-2刺激的T细胞　CML患者的T细胞悬浮在含IL-2（100U/ml）的CM中，细胞浓度为1×10⁶/ml，在24孔板中37℃、体积分数为5%的CO₂以及饱和湿度培养72h，检测其ATK活性。

　　6　自身混合淋巴细胞肿瘤细胞培养(MLTC）　方法参照文献［2，4］稍加修改。CML患者的T细胞悬浮在含抗CD₃单抗（100ng/ml）的CM中，细胞浓度为1×10⁶/ml，在24孔板中37℃、体积分数为5%的CO₂及饱和湿度培养48h后，用含IL-2（终浓度100U/ml）的培养液半量换液，第5天再半量换液，第8天半量换液时加经¹³⁷Cs照射的自身ΔCML（1×10⁵/ml），以后每2～3d半量换液1次，每周用照射的自身ΔCML刺激直至培养第4周末，但末次换液不加IL-2，分别检测T细胞的ATK活性和免疫表型。

　　7　⁵¹Cr释放实验　100μl⁵¹Cr标记的靶细胞（1×10⁴）加入96孔板中，再加入100μl效应细胞（5×10⁵），同时设靶细胞的自然释放组和最大释放组，每组平行3个孔，37℃、体积分数为5%的CO₂孵育4h后离心，各收集上清100μl，用γ闪烁计数仪检测放射性核素每分钟闪烁计数值(CPM)，结果用平均杀伤百分率表示。

　　8　细胞免疫分析　采用免疫荧光法，应用流式细胞仪(FACS Vantage^TM，BD公司）进行分析。检测细胞浆HSP70，同时加抗HSP70单抗和1g/L皂苷。

　　9　统计学分析　数据以±s表示，分别采用配对t检验和χ²检验。

结果

　　1　热休克诱导T细胞对CML细胞的ATK活性　热休克对CML靶细胞的⁵¹Cr自然释放率无影响（ΔCML与δCML比较,t=0.745,P＞0.05)，当效/靶细胞比为50∶1时，T细胞对自身CML靶细胞具有不同程度的ATK活性，T细胞对自身δCML的ATK平均活性，明显低于对自身ΔCML的ATK活性(t =2.678，P＜0.01)。如以ATK活性＞15.0%为阳性，则21例患者中仅有4例患者的自身T细胞对δCML的ATK呈阳性;有10例患者的自身T细胞对ΔCML的ATK呈阳性，两组差异有显著性意义（χ² = 4.850，P＜ 0.05）（表1）。此外，有12例患者对自身ΔCML的ATK活性为0，而热休克后，ATK活性增至（20.2±12.4）%。

表1　热休克前后自身T细胞对CML细胞的ATK活性比较(±s)

　　注：热休克前后比较，*P＞ 0.05，△ P ＜ 0.01

2　IL-2对ATK活性的影响　6例CML患者的T细胞在体外用IL-2刺激72h，其刺激前后的ATK活性变化见表2。IL-2刺激前后的自身T细胞对δCML的ATK活性差异有显著性（t = 2.349，P ＜ 0.05）,比较IL-2刺激前后的自身T细胞对ΔCML的ATK活性差异也有显著性意义（t = 3.316，P＜ 0.01）。与未刺激的自身T细胞对δCML的ATK活性比较，IL-2刺激的自身T细胞对ΔCML的ATK活性明显增加，差异具有非常显著性的意义（t=3.663，P ＜ 0.001）。

表2　IL-2对ATK活性的影响(%，±s)

　　注：# 与同组未加IL-2比较，P＜0.05；△与热休克前加IL-2比较，P＜0.01；*与热休克前未加IL-2比较，P＜0.001

3　热休克对CML细胞表达HSP70的影响　δCML或ΔCML细胞膜均未检测到HSP70表达；加用皂苷处理检测CML细胞浆的HSP70表达，ntCML为（82.91±5.65）%，tCML为（76.14±3.16）%，虽有轻度下降,但差异无统计学意义（t=0.927，P＞0.05）。

　　4　T细胞表型分析　自身MLTC培养前后T细胞的表型变化见表3。

　　5　培养T细胞的ATK活性　T细胞经自身MLTC刺激扩增4周后，应用⁵¹Cr释放法检测自身T细胞对tCML的ATK活性为（51.25±4.26）%，对ntCML的ATK活性为（36.52±3.87）%，而对K562靶细胞无明显细胞毒活性［（2.92±1.19）%］。

讨论

　　对热休克、HSP70和ATK活性观察证明有少数（19.05%）CML患者存在对自身CML细胞的ATK活性，而大部分患者并不存在，这可能与CML细胞IL-10分泌过多或伴有IL-1α分泌减少有关^［4］。体外热休克后能诱导或促进近半数（47.62%）CML患者T细胞的ATK活性，这与42%实体瘤患者的T细胞具有ATK活性基本一致，其诱导的ATK活性不是热休克本身对CML细胞的直接作用^［3］。我们进一步研究了IL-2对ATK活性的影响，IL-2不仅增加CML患者自身T细胞对tCML的ATK活性，而且也增加T细胞对δCML的ATK活性。ATK活性与多种实体瘤患者的预后密切相关，ATK的诱导治疗可延长患者的生存，而IL-2可用于CML患者的治疗，故IL-2联合热休克的治疗可能是CML治疗的一种新方法^［5，6］。

　　热休克等各种应激反应可诱导细胞表达HSP。如果热休克后肿瘤细胞膜HSP70的表达不增加，则自身T细胞对热休克的肿瘤靶细胞无ATK活性^［3］。我们对CML细胞的研究结果与此有所不同，即未检测到热休克后CML细胞膜的HSP70表达，也不能使细胞浆的HSP70转运至细胞膜上，细胞膜是否表达HSP70与热休克诱导的ATK活性可能没有直接关系。CML细胞热休克后诱导的ATK活性可能通过以下途径：① 热休克可能诱导或促进与HSP70结合的白血病抗原肽在细胞膜上表达，从而增加ATK活性；② 热休克可能诱导或促进CML细胞表达各种细胞粘附和协同刺激分子，这些分子加强或诱导自身T细胞对CML细胞的识别和杀伤；③ 由于HSP家族包括HSP90、HSP70、HSP65和HSP27等，我们仅检测了HSP70的表达，不排除有其他HSP表达增加的可能，这有待今后研究证实^［3-8］。

　　HSP70可作为肿瘤抗原呈递分子，对实体瘤的研究发现热休克后细胞内HSP70重新分布并在热休克的肿瘤细胞膜表达^［3，7］。我们也发现在热休克前后CML细胞浆表达HSP70的阳性率无明显变化，但在部分患者CML细胞HSP70的表达从热休克前的1个峰变为2个峰，且平均荧光强度增加，提示热休克可诱导HSP70在细胞浆的重新分布和合成（结果未显示）。

表3　CML患者自身MLTC前后细胞表型的变化（±s）

　　注： MLTC前后比较，*P ＞ 0.05； #P＜0.05；△P＜0.01

　　HSP70是γδ T细胞识别的配体，热休克可诱导或增加ATK活性^［3，7］，因此，我们应用MLTC试图扩增CML患者的γδT细胞。CML患者的T细胞经自身MLTC刺激扩增4周，CD₃⁺T细胞数明显增加，可扩增300倍（结果未显示），而且CD₈⁺ T细胞占绝大部分［（62.09±9.93）%］，CD₄⁺T细胞占少部分［（18.63±1.32）%］，部分细胞呈激活状态，γδ T细胞仅占（0.33±0.24）%，由于CD₃⁺T细胞不是表达TCRαβ就是表达TCRγδ，因此培养后的T细胞表型以TCRαβ⁺CD₃⁺CD₈⁺细胞为主，采用自身MLTC不能刺激扩增 γδT细胞。Pawelec等^［4］也有相似的结果，他们在自身MLTC中加用细胞因子IL-1α和抗IL-10血清刺激扩增CML患者的T细胞，T细胞表型也为TCRαβ⁺CD₃⁺，但以CD₄⁺ T细胞为主。进一步分析发现自身MLTC培养的T细胞对ΔCML和δCML均有ATK活性，但对K562细胞无明显细胞毒活性。由于K562细胞不表达HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分子，且自身MLTC前后CD₅₆⁺细胞无明显变化，因此自身MLTC刺激扩增T细胞的ATK活性是HLA依赖性的，而不是通过NK或LAK细胞的作用。Lim和Pawelec等^［1，4］也证实经自身MLTC刺激扩增的T细胞仅对自身CML细胞有增殖反应，分泌IL-2和IFN-γ，是HLA-DR限制的DTH/Th₁型抗CML特异免疫。Coleman等^［8］则认为CML患者体内存在自身白血病反应性T细胞，但对自身CML细胞反应很弱，大剂量IL-2可部分纠正此缺陷，而且T细胞不杀伤K562细胞，只杀伤自身CML细胞，T细胞对自身CML细胞的反应也是HLA限制性的。

　　总之，热休克处理CML细胞可诱导或促进自身（尤其是IL-2刺激的）T细胞的ATK活性， ATK活性与γδT细胞和CML靶细胞是否表达HSP70无明显关系，未检测到ΔCML细胞膜HSP70表达增加，自身MLTC刺激扩增的T细胞对CML细胞的ATK活性为HLA限制性的。这些发现对探讨CML患者的免疫治疗提供了一定的依据。

　　资助项目：国家卫生部科研基金资助项目（ 96-1-038和98-1-026）

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(收稿日期：1999-10-16)