极限稀释PCR法对急性淋巴细胞白血病微小残留病的检测及意义

中华儿科杂志 1999年第11期第0卷 论著

作者：郭海霞　李文益　邓庆丽　夏焱　薛红漫　方建培

单位：510120　广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院儿科

关键词：白血病；淋巴细胞；急性；聚合酶链反应

　　【摘要】　目的　探讨极限稀释定量PCR法检测追踪急性淋巴细胞白血病(简称急淋，ALL)患儿骨髓微小残留病(MRD)变化的临床意义。方法　改良极限稀释定量PCR方法。结果　敏感度平均为4拷贝。对23例初治MRD阳性的患儿在诱导治疗达到缓解(CR)时的MRD定量检测结果显示：(1)CR时MRD阴性10例，其中8例在追踪期内亦持续阴性，另2例在追踪过程中MRD转为阳性，经强化疗后MRD渐减少至转阴；(2)CR时MRD阳性13例，其中6例CR时MRD平均值为0.064%，在缓解期MRD值逐渐减少，直至转阴；5例CR时MRD值较高或CR期时持续高值，2例CR期MRD值渐增高，此7例均复发；(3)骨髓复发组(7例)CR时MRD定量值平均为0.157%，未复发组(14例)为0.003%(P＜0.05)。结论　采用极限稀释定量法检测ALL的MRD，具有操作简单、敏感性高的优点；持续追踪CR期MRD对指导化疗及预测预后有重要意义。

Quantitative analysis of minimal residual disease and its clinical significance in children with acute lymphoblastic leukemia by limiting dilution assay

GUO Haixia, LI Wenyi, DENG Qingli, et al.

Department of Pediatrics, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, GuangZhou 510120

　　【Abstract】　Objective　To probe into the clinical significance of limiting dilution quantitative PCR in following up of the minimal residual disease (MRD) changes in patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL).Methods A modified limiting dilution assay was applied in this study.Results The average sensitivity was 4 copies. MRD cells were quantitated when induction therapy achieved complete remission (CR) in 23 cases whose MRD of untreated samples were positive: (1) MRD was negative at CR in 10 cases, 8 of them kept negative during following-up and 2 cases turned to positive during following-up and after intensified chemotherapy, MRD decreased gradually to negative. (2) MRD was positive at CR in 13 cases, in 6 cases of them the mean level of MRD was 0.064% at CR, decreased gradually and turned negative at last; MRD level of 5 case was high at CR or persistently high and in 2 cases increased gradually in CR period, the disease relapsed in all these 7 cases; (3) The average amount of MRD cell was 0.157% in marrow relapse group (7 patients) at CR and 0.003% in non-relapse group (14 patients) (P＜0.05).Conclusion The method of limiting dilution quantitative assay has the advantages of simplicity, effectiveness and high sensitivity in detecting MRD in ALL. It has important clinical significance of guiding chemotherapy and predicting prognosis to follow up continuously MRD in CR period.

　　【Key words】　Leukemia，lymphocytic，acute　　Polymerase chain reaction

　　急性淋巴细胞白血病（简称急淋，ALL）是小儿常见的恶性肿瘤。造成ALL复发的重要原因之一是诱导缓解（CR）后体内仍有残留白血病细胞，又称微小残留病（MRD）。近年来，国外应用各种定量方法评价MRD消长及其与临床治疗、预测复发的关系各家报道不完全一致^［1-3］。国内已有竞争PCR定量法的研究^［4］，尚无极限稀释法的报道。我们应用TCRγ、IgH两个基因重排标志检测MRD，探索改良的极限稀释定量 PCR 法检测小儿ALL MRD的可行性及临床意义。通过追踪各治疗阶段及复发时的MRD 消长情况，初步探讨骨髓MRD的变化与临床化疗强度、预测预后、提示复发之间的关系。

　　 对象和方法

　　一、对象和细胞株

　　1994～1998年，在我院儿科初次治疗的23例ALL患儿，男18例，女5例；年龄8个月～13岁。对其中21例进行免疫分型：B系ALL 20例，T系ALL 1例。细胞株：CEM（T-ALL细胞株），Raji（B淋巴母细胞瘤/B-ALL细胞株）。

　　二、方法

　　1.DNA提取：按常规酚／氯仿法。

　　2.PCR扩增：引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成。引物序列如下：

　　循环参数：TCRγ预变性94℃，10分钟，变性95℃，1分钟，退火55℃，1分钟，延伸72℃，1.5分钟，35个循环，总延伸72℃，5分钟。IgH预变性94℃，10分钟，变性92 ℃，30秒，退火58℃，30秒，延伸72℃，1分钟，30个循环，总延伸72℃，7分钟。同时设阳性、阴性、空白对照及重复性试验。电泳：TCRγ、IgH重排PCR产物分别采用1.5%及2.5%琼脂糖。紫外灯下观察荧光带，拍照。

　　3.极限稀释法：每个初诊或复发DNA样本先用紫外分光光度仪测定DNA含量，然后取2 μl加入18 μl正常人DNA稀释10倍，再取稀释后的标本2 μl 加正常人DNA 18 μl稀释，如此重复做系列10倍稀释至10^-6为止。每个稀释度均取2 μl加入到PCR反应液中进行扩增，由PCR扩增阴性时的稀释度即可确定极限稀释的倍数及PCR反应液中的DNA含量。由于1个细胞约含6 pg DNA，故可计算出稀释极限时的细胞拷贝数，即扩增TCRγ V-J片段或IgH基金重排的第三互补决定区CDRⅢ片段的灵敏度。对CR后各期样本用上述方法确定具体极限稀释倍数，乘以该病人的灵敏度即可计算出此样本的MRD细胞数。由此样本DNA浓度计算出有核细胞数，MRD的定量以MRD细胞占有核细胞的比例表示。

　　三、统计学处理

　　分析初治病例CR时的MRD值与预后的关系，计算几何均数，两均数比较采用秩和检验。显著性检验采用双侧检验，定显著性标准为α=0.05。

　　结果

　　一、PCR敏感度的测定及DNA收获

　　提取CEM、Raji DNA，PCR扩增TCRγ、IgH的敏感度均为2拷贝（MRD定量值0.001%），初治、复发骨髓样本敏感度平均值为4拷贝。分离初治病例骨髓单个核细胞，计算DNA收获约5.6～6.2 μg/10⁶细胞。

　　对15个患儿的57份样本进行定量分析，其中48份(84%)样本可精确到一个数量级，9份(16%)样本相差一个数量级。

　　二、21例初治病例(已做免疫分型)TCRγ、IgH重排阳性率

　　PCR扩增TCRγ Vr1-8/Jr1基因片段，阳性产物为400 bp左右片段；IgH CDR Ⅲ靶序列，阳性产物为100 bp左右片段。本实验PCR扩增B系20例ALL TCRγ阳性率64.3%，IgH阳性率85.7%；1例T系ALL TCRγ阳性，IgH 阴性。20例B系ALL初治病例中双基因重排覆盖率95%。

　　三、MRD细胞的定量检测结果

　　对23例患儿在CR时进行了MRD定量检测，并追踪至CR后4～37个月，结果如下。

　　1. CR时MRD阴性的有10例，其中持续阴性（即MRD值小于0.001%）的8例，临床持续缓解；MRD 转阳的2例（分别为0.017%、0.020%），其中1例发生中枢神经系统白血病（CNSL），经较强的巩固化疗及CNSL治疗后，这2例 MRD均减少至转阴，临床缓解，现还在继续追踪中。

　　2. CR时MRD阳性的有13例：(1) MRD逐渐减少的6例，平均由0.064%逐渐减少至转阴，除死于肺炎1例、失访1例外，余4例尚未骨髓复发。但其中1例发生睾丸白血病。(2)MRD持续高值的4例（平均值为0.357%），于复发前3个月有增加趋势的 2 例，另1例（0.497%）因不久即复发未能定量追踪复发前MRD消长情况。此7例骨髓复发。其中死亡2例；经强诱导化疗（COLDDex/IA）再次缓解3例，MRD值渐减少。其中1例已转阴；1例随访中；1例放弃治疗。

　　3.21例(除去1例死于肺炎，1例失访)MDR定量值按＞0.1%、0.1%～0.002%及＜0.002%分成3组，各组病例数分别为第1组6例，第2组4例，第3组11例。而复发例数分别为第1组5例，第2组1例，第3组1例。

　　综合上述结果，骨髓复发组（7例，其中高危型4例）CR时MRD定量值平均为0.157%，与同期未复发组（14例，其中高危型4例）0.003%相比，差异有显著意义（P＜0.05）。复发组高危型所占比例显著高于未复发组（P＜0.05）。

　　讨论

　　一、极限稀释定量法优点

　　定量检测残留白血病细胞有不同的方法，包括极限稀释法、竞争PCR法。噬菌体定量法、探针检测法和荧光定量PCR法，不同方法各有其优缺点。极限稀释法是剂量依赖的生物方法，首先应用于免疫活性细胞计数，由Brisco等^［5］将此方法改造用于检测白血病MRD 。改良后的极限稀释法是以扩增的有或无为终点。其重复性实验结果显示，81%样本定量精确到一个数量级，其余19%可能是因为稀释极限时靶的随机分布而相差一个数量级。鉴于白血病细胞数量变化大，此精确度对现有研究是足够的。此改良法的优点是：(1)简单；(2)存在不同靶DNA扩增时的强有效性；(3)信号强而清晰。本实验将扩增条件优化，敏感度为平均4拷贝。采用本法对57份标本进行定量分析，其中48份（84%）样本可精确到一个数量级，9份（16%）样本相差一个数量级，与文献［5］报道基本一致。

　　二、定量MRD检测的临床意义

　　应用敏感、客观、快速的PCR技术，在病程中对MRD进行定量追踪，有助于分析、探讨MRD 水平变化与临床病情变化的关系。为此本实验追踪了23例患儿，以探讨CR时MRD水平及对病情的预测价值。Brisco等^［2］报道MRD水平按高（≥0.1%）、中（0.1%～0.002%）、低（＜0.002%）分组，复发率分别为100%(5/5)、40.0%（4/10）、6.9%（2/29）。本实验按此分组法，复发例数分别为6例中有5例、4例中有1例、11例中有1例。且复发组CR时MRD的定量值与同期未复发组相比差异有显著意义（P＜0.05）。此结果说明CR时MRD值低（肿瘤负荷低）的病人预后较好，但仍应严密追踪，注意MRD变化；而MRD水平高者容易复发，应予以注意并加强化疗。两组临床分型差异有显著意义，说明MRD定量检测与临床分型的预测基本一致。

　　坚持定量追踪MRD，可见如下几种情况：(1)MRD持续阴性8例，临床持续缓解。CR时MRD阴性可能与近年的诱导化疗方案较强有关，与国外文献报道一致^［2,3］。(2)MRD由阴转阳的2例经较强的巩固化疗及CNSL的治疗后MRD渐减少至转阴，临床缓解。除说明巩固化疗的必要性外，也说明定量追踪有重要作用。(3)MRD逐渐减少6例，其中5例临床和骨髓形态学均持续缓解；1例MRD值CR后22个月时减至0.009%，但此时发生睾丸白血病。提示MRD定量检测较形态学及定性检测能更好地反映病情变化，并提示化疗药物的杀伤效应在白血病缓解后的早期对MRD细胞数量减少有一定作用。有文献报道，当白血病细胞数量减少到一定数量后化疗药物难以对骨髓及隐蔽所MRD细胞起有效的清除作用^［6］。此时需增强机体免疫力，给予生物反应调节剂，控制白血病细胞生长，改变免疫监视，使肿瘤细胞与正常骨髓微环境相互作用。本组发生睾丸白血病的病例符合这一观点。(4)MRD持续高值或逐渐增高7例，本组复发率明显增高。文献表明治疗1 年内的复发可能与原发耐药有关，晚期复发可能由于诱导方案不强造成。早期复发病人预后较差，晚期复发病人预后则较好^［6］。本实验结果亦支持此观点，但部分早期复发病人给予强联合再诱导方案，仍可部分改善预后。因此，对CR时MRD阳性的病人应持续监测其水平，若持续高值或增高，应予强化疗以防止复发。由于病例数所限，仍需加大追踪病例数， 延长追踪时间，以证实上述观点。

　　资助项目：本课题由广东省卫生厅科研基金资助(项目编号：A1997148)

　　参考文献

　　1　Cave H，Guidal P，Rohrlich P，et al. Prospective monitoring and quantitation of residual blasts in childhood acute lymphoblastic leukemia by polymerase chain reaction study of δ and γ T-cell receptor genes. Blood，1994, 83：1892-1902.

　　2　Brisco MJ，Condon J，Hughes E，et al. Outcome prediction in childhood acute lymphoblastic leukemia by molecular quantification of residual disease at the end of induction. Lancet，1994, 343：196-200.

　　3　Roberts WM，Estrov Z，Ouspenskaia MV，et al. Measurement of residual leukemia during remission in childhood acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med，1997, 336：317-323.

　　4　刘乐宇，殷慧君，孙金英，等. 急性白血病微量残留细胞定量分析及其临床意义. 中华儿科杂志，1997, 35：239-241.

　　5　Brisco MJ，Condon J，Sykes PJ，et al. Detection and quantitation of neoplastic cells in acute lymphoblastic leukemia by use of the polymerase chain reaction. Br J Haematol，1991, 79：211-217.

　　6　殷慧君，主编. 小儿急性白血病化学治疗. 北京：科学出版社，1996. 69-70.

收稿：1998-08-10

　　修回：1999-02-12