RT-PCR检测白血病患者mdr1表达的临床研究
临床血液学杂志 2000年第4期第13卷 临床研究
作者:韩艳秋 杨海萍 邰秀珍 杨殿相
单位:韩艳秋(内蒙古医学院附属医院内科呼和浩特,010059);杨海萍(内蒙古医学院病理生理教研室);邰秀珍(内蒙古医学院附属医院内科呼和浩特,010059);杨殿相(内蒙古医学院病理生理教研室)
关键词:白血病;聚合酶链反应;多药耐药基因表达
摘要 目的:应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测多药耐药基因(mdr1)mRNA的表达,以探讨白血病细胞的抗药性与化疗效果的关系。方法:采用RT-PCR法检测33例不同类型白血病患者mdr1 mRNA的表达,同时检测20例正常骨髓做对照。结果:对照均为阴性表达,而初治组mdr1的阳性表达率为35.00%,复发、难治组mdr1阳性表达率为84.62%(P<0.01),mdr1阳性与mdr1阴性患者的完全缓解率分别为22.22%和73.33%(P<0.01),临床耐药与非耐药组mdr1阳性检测率分别为77.78%和26.67%(P<0.01)。结论:临床白血病化疗耐药的发生主要与mdr1阳性表达有关。RT-PCR是一种敏感性高、特异性强,可定量检测mdr1表达的手段。mdr1表达可作为一个临床化疗耐药指标,有助于白血病个体化疗方案制定。
A clinical study on multidrug resistance gene
expression in leukemia by using reverse transcription
polymerase chain reaction
HAN Yang-qiu TAI Xiu-zhen
(The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical College,Hohhot,010059)
YANG Hai-ping YANG Dian-xiang
(Department of Pathopysiology Inner Mongolia Medical College)
Abstract Objective:In order to evaluate relationship between drug resistance of leukemia cells and prognosis.Methods:The expression of multidrug resistance gene( mdr1)mRNA was measured in 33 patients with different type leukemia and in 20 normal marrow controls by using reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).Results:The normal marrow was all mdr1 negative. The mdr1 positive rate in untreated group was 35.00%. The mdr1 positive rate of refractory relapsed group was 84.62%(P<0.01). The CR rate differed significantly between mdr1 positive group (22.22%)and mdr1 negative group(73.33%)(P<0.01).The mdr1 positivity of the clinical resistance group was 77.78%,while that of the clinical non-resistant group was 26.67% (P<0.01). We found that mdr1 gene expression correlated well with drug resistance to chemotherapy in the patients with leukemia.Conclusion:We thought that the determination of mdr1 expression level in leukemia could provide a valuble information for designing chemotherapetic regimen in individual patient, and a high level of mdr1 expression correlated closely with drug resistance in clinical leukemia chemotherapy.
Key words Leukemia Polymerase chain reaction Multidrug resistance gene expression
目前治疗白血病的主要方法仍为化疗,而化疗成功的主要障碍之一是瘤细胞对化疗药物产生的交叉耐药性〔1,2〕。研究证实,多药耐药基因(mdr1)及其基因产物胞膜糖蛋白(P170)起着多药耐药的作用。现已证实mdr1基因的过度表达与白血病的预后有直接关系,mdr1表达的程度与化疗疗效及化疗方案选择有相关性〔1〕。我们对33例白血病患者mdr1进行分析研究,为克服白血病的多药耐药性提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 临床病例
(1)白血病患者33例,均符合FAB诊断标准,留取骨髓标本33份,其中急性非淋巴细胞白血病(ANLL)20份(M2 8份,M3 7份,M5 4份,M6 1份),急性淋巴细胞白血病(ALL)9份,慢性粒细胞白血病急变3份,浆细胞白血病1份。其中初治组20份(M2 6份,M3 5份,M5 3份,M6 1份,ALL 4份,浆细胞白血病1份),复发、难治组13份。男20例,女13例,年龄9~62(平均31.0)岁。难治或临床耐药白血病诊断标准见文献〔3,4〕。(2)采用20例献血员的正常骨髓作对照,其中男9例、女11例,年龄18~50(平均33.0)岁。
1.2 细胞分离及总RNA提取
抽取骨髓2 ml,肝素抗凝,用淋巴细胞分离液(上海试剂二厂生产)2000 r/min离心20 min,分离单个核细胞,液氮保存,所用标本约10 μg,采用异硫氰酸胍一步法(AGPC)略加改进提取细胞总RNA,用紫外分光光度计测RNA浓度和纯度,用灭菌的琼脂糖凝胶电泳确定RNA质量。
1.3 cDNA合成
取变性的RNA 0.5 μg加入5 μl的AMV逆转录酶反应体系中,其中使用的引物为随机引物,在37 ℃ 10 min,42 ℃ 30 min,合成cDNA。
1.4 PCR扩增
(1)引物设计及合成:扩增基因mdr1及内对照β2-mG引物设计参照文献〔5〕,由北京赛百盛生物工程公司合成,mdr1 5′引物CCCATCATTGCAAT-AGCAGG(2596-2615),3′引物GTTCAAACTTCT-GCTCCTGA(2733-2752),扩增片段为157 bp。内对照β2-mG,5′引物ACCCCCACTGAAAAAGAT-GA(1543-1562),3′引物ATCTTCAAACCTCCAT-GATG(2253-2262,3508-3517),扩增片段为114 bp。(2)PCR反应体系为25 μl,包括50 mmol/L MgC12 0.8 μl,10×buffer 2.5 μl,dNTP 2.5 μl,5 pmol混合引物2.5 μl, Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)0.5 μl,cDNA模板2.5 μl,余量用三蒸水补足混匀,94 ℃变性40 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸60 s,扩增30个循环。(3)PCR产物分析:取PCR产物5 μl加1 μl载样缓冲液,在20 g/L琼脂糖凝胶上电泳(65 V,2 h),溴化乙锭染色,紫外灯下观察结果并照相,底片在光密度扫描仪上扫描定量,用mdr1 cDNA/β2-mG cDNA比值表示mdr1 mRNA的表达水平。
1.5 统计学处理
采用Fisher确切概率法和t检验。
2 结果
利用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术和设定的两对引物,分别得到mdr1 157 bp和β2-mG 114 bp产物,同一批反应的不同样本,在扩增模板量相同的情况下,其mdr1表达明显不同,而β2-mG表达却基本相同,PCR的阳性结果以肉眼能见其电泳扩增带为判断标准,当被检标本经PCR后同时出现mdr1及β2-mG基因PCR电泳扩增带时,判定该标本mdr1 PCR检出阳性,结果如图1。
图1 PCR产物电泳结果
M:Marker, 1~6为患者, 1、2、3、5、6
为mdr1阳性表达, 4为阴性表达
对照组20例正常骨髓标本经PCR后均出现β2-mG基因扩增带,且均未检出mdr1基因扩增带;33例白血病患者骨髓标本中共检出18例mdr1阳性。
初治组与复发难治组患者mdr1阳性表达比较见表1。
表1 初治组与复发难治组mdr1阳性表达比较
组 别 |
例 数 |
mdr1 |
阳性率(%) |
mdr1 cDNA/
β2-mG cDNA |
0 |
<0.2 |
0.2~0.4 |
>0.4 |
初治组 |
20 |
13 |
3 |
2 |
2 |
35.00 |
0.2721±0.1361 |
ANLL |
15 |
10 |
2 |
1 |
2 |
ALL |
4 |
2 |
1 |
1 |
浆白 |
1 |
1 |
复发、难治组 |
13 |
2 |
|
5 |
6 |
84.621) |
0.4755±0.12591) |
ANLL |
5 |
1 |
|
|
4 |
ALL |
5 |
1 |
|
3 |
1 |
CML急变 |
3 |
|
|
2 |
1 |
与初治组比较 1) P<0.01
白血病患者mdr1阳性表达与阴性表达者完全缓解(CR)率比较,mdr1阳性表达18例,CR4例,CR率22.22%,mdr1阴性表达15例,CR11例,CR率73.33%,经Fisher法分析P<0.01,差异有极显著意义。
临床耐药与非耐药组mdr1 mRNA检测结果比较,耐药组(18例)mdr1阳性表达14例,阳性率77.78%,非耐药组(15例)mdr1阳性表达4例,阳性率26.67%,经Fisher法分析P<0.01,差异有极显著意义,耐药组与非耐药组的mdr1 cDNA/β2-mG cDNA比值分别为0.4196±0.1559、0.1621±0.0445,经t检验,P<0.05,差异有显著性意义。
白血病mdr1 mRNA表达与白血病临床特征的关系:本组ALL和ANLL的mdr1基因表达与年龄、性别、诊断时骨髓幼稚细胞及增生程度、 FAB分型未发现有显著相关性。本组对2例ANLL-M2患者初治及复发时均进行mdr1检测,结果初治时均为阴性表达,经化疗后均达CR,1例CR后继续化疗,半年后复发,mdr1表达转成阳性,再次化疗效果差,最终死亡;另1例CR后服用蒙药治疗,8个月后复发,mdr1表达仍为阴性,化疗后再次达CR。在复发、难治组中,有1例ANLL-M3患者,mdr1高度表达,该患者为住院联合化疗中复发的,但改用复方柏子仁(砷剂)治疗后达CR,至今已2年。在初治组中有1例 ANLL-M3患者中度表达,该患者未用联合化疗,采用三氧化二砷静脉滴注治疗达CR,至今已2年。另1例ANLL-M3患者,mdr1高度表达,住院期间曾用高三尖杉酯碱加阿糖胞苷方案化疗,疗效差,由于经济困难,出院后改用阿糖胞苷及环磷酰胺治疗达CR。
3 讨论
我们检测了20例正常人骨髓标本,其mdr1表达均为阴性。检测20例初治急性白血病患者mdr1 mRNA阳性率为35.00%,其中ANLL为33.33%(5/15)、ALL为50%(2/4),本组ANLL与ALL的mdr1表达无显著性差异(P>0.05),与Zhou和 Campos曾报道〔6,7〕ANLL的mdr1基因表达率相似。本结果提示这种原发性mdr1基因表达增加可导致耐药的现象不仅见于ANLL,也见于ALL。
本研究显示,复发难治组mdr1阳性率明显高于初治组,而mdr1阳性组临床CR率明显低于mdr1阴性组,两项指标均有显著意义(均为P<0.01)。临床耐药组与非耐药组的 mdr1阳性率,有显著性差异(P<0.01),提示由mdr1介导的耐药是白血病多药耐药的重要机制。在治疗中发现患者的耐药性与mdr1的表达程度有一定的相关性,mdr1高度表达者,临床常规化疗方案难以获得缓解,使用的常规化疗方案多是以MDR相关药物为主,如阿霉素、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙等,它们不能克服mdr1表达所致的细胞耐药,这也是患者不能获得缓解的主要原因。而复发的患者如mdr1阴性表达,则经常规方案化疗后易达到再次CR。研究证明,以阿糖胞苷、环磷酰胺等非mdr1相关药物治疗mdr1阳性的白血病可提高其缓解水平〔8〕。
mdr1 cDNA/β2-mG cDNA的比值高低与临床上患者对化疗药物的敏感性之间有较好的相关性,可望为临床提供一个有意义的指标,临床医师可根据患者mdr1的表达情况,合理地制定化疗方案,使化疗发挥最有效的作用。
参考文献
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(收稿 1999-09-08 修回 2000-02-23)