HPV16E6E7转导的卵巢癌细胞系顺铂耐药性的变化
解剖学报 2000年第2期第0卷 论著
作者：曹善津 钱和年 冯捷 付天云 叶雪 刘蓓 姚煜 刘广芝
单位：曹善津 钱和年 冯捷 付天云 叶雪 刘蓓 姚煜 刘广芝(北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心，北京 100034)
关键词：卵巢肿瘤；耐药性；人乳头瘤病毒
【摘要】 目的 人乳头瘤病毒16型E6E7区基因编码的蛋白具有转导人上皮细胞，使之获得永生化特性的作用。为建立卵巢癌永生细胞系，我们对HPV16E6E7转导卵巢癌细胞的方法及转导细胞对顺铂的耐药性进行了研究。 方法 采用脂质体方法，将含有HPV16E6E7的重组逆转录病毒载体pLXSN16E6E7，转染逆转录病毒包装细胞PT67，经G418筛选，病毒滴度测定，筛选出1株高滴度(1.9×107/ml)的产病毒克隆，将之转导卵巢癌细胞系SKOV3、3AO，各筛选出1株稳定表达HPV16E6E7的克隆，SKOV3/E6E7、3AO/E6E7。经RT-PCR、免疫细胞化学检测证实HPV16E6E7的表达，之后采用MTT法检测了HPV16E6E7转导的卵巢癌细胞系对顺铂耐药性的变化。结果 HPV16E6E
7转导的卵巢癌细胞系SKOV3/E6E7、3AO/E6E7对顺铂的耐药性无改变。 结论 HPV16E6E7转导的卵巢癌细胞没有发生顺铂耐药性的改变。本研究为采用此法建立卵巢癌永生细胞系，特别是建立耐药卵巢癌细胞系奠定了基础。
【中图分类号】 Q28 【文献标识码】 A
【文章编号】 0529-1356(2000)02-148
CISPLATIN-RESISTANT CHANGES OF HPV16E6E7 TRANSFORMED
OVARIAN CARCINOMA CELL LINES
CAO Shan-jin,QIAN He-nian,FENG Jie,FU Tian-yun,YE Xue,LIU Bei,YAO Yu,LIU Guang-zhi
(Gynecologic Oncology,People's Hospital,Beijing Medical University,
Beijing 100034, China)
【Abstract】 Objective Human papillomavirus type 16 E6E7 region(HPV16E6E7)gene coded protein can transform human epithelial cells,and make them immortalized.In order to establish immortal ovarian carcinoma cells, we established the method of HPV16E6E7 transforming ovarian carcinoma cells,of which the cisplatin-resistant changes were also studied. Methods Using lipofectin method to introduce the recombinant retrovirus plasmid pLXSN16E6E7 containing the HPV16E6E7 into a retrovirus packaging cell line PT67,after G418 screening,and determination of the virus titer,a cell strain with high virus titer(1.9×107)was chosen to transduct ovarian carcinoma cell lines SKOV3,3AO,a transformed cell line permanently expressing HPV16E6E7 was selected respectively,which was identified by RT-PCR and immonocytochemistry.The drug-resistant ability to cisplatinum of the transformed cells was tested by means of MTT method. Results No change was found in the cisplatinum resistance of the HPV16E6E7 transformed ovarian carcinoma cell lines. Conclusion The drug-resistant changes were not found in HPV16E6E7 transformed ovarian cells.The above study lay a foundation for the establishment of immortal ovarian carcinoma cell lines by means of HPV16E6E7 transduction,especially the drug-resistant ovarian ones.
【Key words】 Ovarian neoplasms/drug-resistance; Human Papillomavirus
卵巢癌已成为妇科肿瘤第一位的死亡原因。常规治疗包括手术、化疗、放疗。尽管手术范围不断扩大，新的化疗药物不断涌现，但是其5年存活率并未因此而明显提高，其原因之一在于卵巢癌的耐药［1］，所以研究其耐药机理及其生物学行为是卵巢癌防治最迫切的研究课题。然而，由于卵巢癌病理类型复杂，目前尚缺乏齐全的细胞系。卵巢癌细胞体外原代培养又很困难，因而限制了对其进一步的研究。人乳头瘤病毒16型E6E7(HPV16E6E7)区基因编码的蛋白具有转化能力，可以使人的上皮细胞永生化［2］，因而，利用HPV16E6E7转导卵巢癌原代细胞，建立卵巢癌永生细胞系(包括耐药的细胞系)，或许会对卵巢癌耐药研究提供理想的模型。但是用HPV16E6E7转导卵巢癌细胞建立的细胞系是否会发生耐药性的改变，又成为人们关注的问题。
材料和方法
1. 含有HPV16E6E7重组逆转录病毒载体pLXSN16E6E7
由美国华盛顿大学Galloway D A教授惠赠。采用EcoRI、BamHI进行酶切鉴定。其结构模式图如下：
2. 逆转录病毒的包装及滴度测定
pLXSN16E6E7以及pLXSN空载体采用脂质体方法(保灵曼公司DOTAP)，转染逆转录病毒包装细胞PT67(CLONTECH RetroPackTMPT67)。具体步骤如下：(1)转染前20h传代PT67，使转染时细胞密度达到30%～40%汇合，(2)准备DOTAP/DAP混合物(以25ml的培养瓶的转染为例)：25μg的质粒DNA(按质粒的大量制备［3］的方法制备)以20mmol/L,pH7.4Hepes缓冲液稀释至25μl，DOTAP15μl以上述同样的Hepes缓冲液稀释至50μl，两者混合，室温孵育1h，(3)将PT67的培养基换以含DOTAP/DNA的新鲜培养基，37℃孵育10h，之后换为完全培养基，(4)48h后，开始G418筛选。大约2周后出现抗性克隆，采用滤纸法消化转移单克隆［4］，扩大培养，至产病毒细胞株80%融合时，换液收集24h的病毒液。病毒滴度的测定采用生物学方法［5］，经测定筛选出1株产pLXSN16E6E7病毒滴度达1.9×107/ml的产病毒细胞株，和1株滴度达5.6×106产pLXSN病毒株。
3. 卵巢癌细胞系的转导［4］
SKOV3、3AO均系卵巢上皮癌细胞系。SKOV3来自美国模式培养物保藏所(ATCC)，3AO来自中国科学院上海细胞库，由本室冻存、传代培养。传代24h后，使细胞达到30%～40%汇合，将收集的24h病毒上清，加Polybrene(Sigma)至8mg/L,0.45μm微型滤器过滤，加入上述细胞中，感染24h后，换为完全PRML 1640，再过48h，1∶5传代入G418筛选培养基中，G418浓度为600mg/L，每4～5d换液1次，至2周左右出现克隆，仍采用滤纸消化法转移克隆，此时G418降为300mg/L维持，扩大培养。
4. 转导的卵巢癌细胞系HPV16E6E7表达检测
采用RT-PCR和免疫细胞化学方法，各筛选出1株HPV16E6E7稳定表达克隆。
4.1 RT-PCR:采用GIBCO公司的TRIZOL试剂提取SKOV3/E6E7,SKOV3/pLXSN,SKOV3;3AO/E6E7，3AO/pLXSN,3AO细胞的总RNA，取2μg总RNA，采用随机引物法进行反转录，然后进行HPV16E6E7的聚合链酶反应。HPV16E6E7的引物由SyberSyn公司合成。
正义链：5′-TGACTTTGCTTTTCGGGATT-3′
反义链：5′-GAGAACAGATGGGGCACAC-3′
同时扩增3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为反应内参照GAPDH引物也由CyberSyn公司合成。引物序列为：
正义链：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTGGTAT-3′
反义链：5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′
其扩增产物分别为616bp和306bp。逆转录反应在25μl反应体系中，总含RNA 2μg，随机引物0.5μg,200u M-MLV，按Promega公司M-MLV说明书进行。HPV16E6E7的PCR扩增条件为：PCR条件：95℃，1min;50℃ 1min；70℃，1min；35个循环，后延伸70℃，10min。GAPDH的PCR条件为：95℃ 1min；47℃ 1min；70℃ 1min，35个循环。
4.2 免疫细胞化学：对pLXSNHPV16E6E7、pLXSN转导的SKOV3、3A0细胞系进行了HPV16E7表达的免疫细胞化学染色，HPV16E7抗体购自中山公司，采用过氧化物酶标记的链霉卵白素(SP)法［6］。
5. MTT法检测转导细胞系耐药性的变化［7］
将80%左右融合的SKOV3/16E6E7、SKOV3/pLXSN、SKOV3,3AO/16E6E7、3AO/pLXSN、3AO细胞，以0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化，以完全RPMI 1640调整细胞浓度至2×105，将顺铂(齐鲁制药厂10mg/支)以完全RPMI 1640配成400mg/L、200mg/L、100mg/L、40mg/L、20mg/L、10mg/L、2mg/L、0mg/L。每个试验孔设3个平行孔。(1)顺铂杀伤孔：细胞、顺铂溶液各取50μl;(2)顺铂对照孔：完全RPMI 1640、顺铂溶液各取50μl；(3)细胞对照孔：完全RPMI 1640、细胞各50μl；(4)调零孔：完全RPMI 1640 100μl。37℃ 5%CO2孵箱培养24h后，加MTT(10g/L)，每孔20μl,37℃ 5%CO2孵箱再培养4h，之后每孔加10%酸性SDS 100μl，室温12～16h。顺铂杀伤孔以不同浓度的顺铂对照孔调零，而细胞对照孔则以调零孔调零，酶标仪(DG-3022型酶联免疫检测仪)以560nm的波长测定A值。按下列公式计算细胞增长抑制率。试验重复两次。抑制率=(细胞对照孔A值-顺铂杀伤孔A值)/(细胞对照孔A值)×100%。
结果
1. 含有HPV16E6E7的重组逆转录病毒质粒pLXSN16E6E7经EcoRI、BamHI酶切释放出1个800bp左右的片段(图1)。
1 PLXSN16E6E7的酶切鉴定
1.φ174DNA/Hae Ⅲ分子量标准 2.pLXSN16E6E7/EcoRⅠ+BamHⅠ酶切 3.pLXSN16E6E7/EcoRⅠ酶切 4.pLXSN/EcoRⅠ酶切 5.pLXSN16E6E7/EcoRⅠ+BamHⅠ酶切
Fig.1 Digesting of PLXSN16E6E7 with restriction endonuclease
1,φ174 DNA/Hae Ⅲ marker 2,pLXSN16E6E7/EcoRⅠ+BamHⅠ 3,pLXSN16E6E7/EcoRⅠ4,pLXSN/EcoRⅠ 5,pLXSN16E6E7/EcoRⅠ+BamHⅠ
2. HPV16E6E7转导的SKOV3、3AO细胞，经RT-PCR，可出现一616bp的特异性扩增带，而转导PLXSN空载体或未转导的原始细胞则无HPV16E6E7的表达(图2)。
2 HPV16E6E7表达的RT-PCR
1.HPV16E6E7转导的SKOV3细胞 2.pLXSN空载体转导的SKOV3细胞 3.SKOV3细胞 4.HPV16E6E7转导的3AO细胞5.pLXSN空载体转导的3AO细胞 6.3AO细胞 7.φ174DNA/HaeⅢ分子量标准
Fig.2 The expression of HPV16E6E7 detected by RT-PCR
1，SKOV3/E6E7 2，SKOV3/pLXSN 3，SKOV3 4，3AO/E6E7 5，3AO/pLXSN 6，3AO 7，φ174DNA”Hae Ⅲ marker
3. HPV16E6E7转导的SKOV3、3AO细胞，SKOV3/E6E7,3AO/E6E7进行HPV16E6E7表达的免疫细胞化学检测，可见细胞核内出现棕黄色颗粒，而对照原始SKOV3，3AO则无表达(图3)。
3 HPV16E6E7表达的免疫细胞化学检测
3a.HPV16E6E7转导的SKOV3(SKOV3/E6E7) 3b.原始SKOV3(SKOV3) 3c.HPV16E6E7转导的3AO(3AO/E6E7) 3d.原始3AO(3AO)
Fig.3 The expression of HPV16E6E7 detected by immunocytochemistry
3a,SKOV3/E6E7 3b,SKOV3 3c,3AO/E6E7 3d,3AO
4. 不同浓度顺铂对HPV16E6E7转导的卵巢癌细胞的抑制率见图4、5。经t检验，HPV16E6E7转导的卵巢癌细胞系与转导pLXSN空载体和未转导的原始细胞系之间，对于顺铂的敏感性无差异(P＞0.5)。
4 HPV16E6E7转导的SKOV3细胞对顺铂的敏感性
Fig.4 Cisplatinum-sinsitivity of HPV16E6E7
transformed SKOV3 cells
5 HPV16E6E7转导的3AO细胞对顺铂的敏感性
Fig.5 Cisplatinum-sinsitivity of HPV16E6E7 transformed 3AO cells
讨论
卵巢癌预后不佳与其耐药有关，因而研究卵巢癌癌变机理、耐药机理及其生物学行为是妇科肿瘤工作者最迫切的研究课题。但是，目前缺乏合适的模型。有报道，HPV16E6E7蛋白具有转化功能，可以使人的上皮细胞永生化，已可使人的支气管上皮、乳腺上皮、膀胱上皮、宫颈上皮细胞永生化［8～12］，因而我们设想它是否可以使人的卵巢上皮永生化，因为卵巢的生发上皮具有化生为输卵管、子宫内膜、宫颈、膀胱上皮的能力，而且其来源的上皮性肿瘤又是卵巢癌最常见的肿瘤，约占卵巢恶性肿瘤的70%。如能应用此法建立正常卵巢上皮细胞系，则可用于卵巢癌癌变机理的研究：建立卵巢癌细胞系，特别是耐药卵巢癌细胞系，有可能建立不同病理类型、不同分化程度，甚至不同生物学特性，种类齐全的卵巢癌细胞系，用于卵巢癌生物学行为、耐药等的研究。这两方面必将对卵巢癌的深入研究起到极大的推进作用。
而这一切的实现都依赖于HPV16E6E7基因转导体系在卵巢癌是否可行。本研究从逆转录病毒载体的转染，逆转录病毒的包装、滴度测定、靶细胞转导及其表达检测，说明此程序及方法是可行的，而且已经筛选出1株产生HPV16E6E7逆转录病毒的高滴度细胞株，从而为利用HPV16E6E7转化卵巢癌原代细胞制备卵巢癌永生细胞系奠定了基础。
应用HPV16E6E7转导耐药卵巢癌细胞，建立耐药卵巢癌细胞系，无疑会对卵巢癌的耐药机理以及其治疗研究提供模型。然而，HPV16E6E7转化的卵巢癌细胞的耐药性是否会发生改变，又成为人们关注的问题。本研究通过HPV16E6E7转导的卵巢癌细胞系，与转导pLXSN空载体和未转导的原始细胞系作对照，研究了其对卵巢癌化疗最常用药物-顺铂敏感性的差异，结果显示，转导的细胞系与空载体转导或未转导的原始细胞系之间，对顺铂的敏感性没有变化。提示应用此法建立耐药卵巢癌细胞系可能不会改变其耐药性。
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39870854)
作者简介：曹善津(1964—)，男(汉族)，河北省元氏县人，医学博士，主治医师
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【收稿日期】1999-03-05
【修稿日期】1999-08-30
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