摘　要　目的　筛选卵巢癌泰素耐药相关基因。方法　采用间歇诱导法建立了卵巢癌泰素耐药细胞株Skov3/Taxol-25;采用mRNA DD比较Skov3/Taxol-25和敏感细胞Skov3的mRNA表达差异，筛选卵巢癌泰素耐药相关基因。结果　Skov3/Taxol-25对泰素耐药增加44倍，同时对顺铂也产生了耐药。比较Skov3和Skov3/Taxol-25的mRNA，获得22个差异条带。对其中5个差异条带进行了DNA序列测定，有3个与已知的基因高度同源，分别为tPA、Kiaa0372和LDLC。2个为未知新基因片段，Genbank登录号分别为AF120327和AF120328。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)显示，tPA和Kiaa0372为Skov3/Taxol-25特异表达基因，而LDLC为假阳性。结论　卵巢癌对泰素耐药后有多个基因表达差异。耐药细胞株的tPA表达增强提示发生耐药后肿瘤的转移能力增强。

　　关键词：卵巢肿瘤　抗药性　基因

　　化疗耐药是卵巢癌治疗失败的主要原因之一，与多个耐药相关基因的表达有关。但有些耐药现象并不能用已知的耐药基因的表达来解释，需要筛选新的耐药相关基因^［1］。mRNA差异显示(mRNA DD) 是基于PCR比较mRNA差异表达的技术，被广泛用于筛选表型相关基因^［2］。本研究采用mRNA DD比较了卵巢癌泰素耐药细胞株SKOV3/Taxol-25和敏感株Skov3的基因表达差异。

　　材料和方法

　　一、耐药细胞株的建立^［3］

　　卵巢癌上皮细胞系Skov3为本室保存。Skov3在指数生长期时，在培养基中加入泰素（美国施贵宝产品），24～48 h后换不含药物的10%小牛血清1640培养基继续培养。大部分细胞死亡，存活细胞缓慢生长，1～3周后再进入指数生长期，重复泰素诱导，共30次，剂量从10、15 nmol/L增至25 nmol/L，历时12个月。MTT法测定耐药指数（RI）。耐药细胞株命名为Skov3/Taxol-25。

　　二、mRNA DD筛选耐药基因^［2，4］

　　1.细胞总RNA的提取及鉴定：用TRIzol RNA纯化试剂盒（美国GIBCO产品）提取指数生长期细胞Skov3/Taxol-25和Skov3的总RNA。 分析鉴定样品纯度和浓度，DNA酶消化。

　　2．mRNA差异显示：以Archered primer-H-T11M(M分别为A，G，C的一种)为引物，反转录合成Skov3/Taxol-25和Skov3 cDNA第一链，然后以3条Archered primer与随机引物作不同组合进行PCR反应,反应条件：94℃ 30 s，40℃ 2 min，72℃ 1 min，40个循环，72℃延伸7 min。取相同引物下两个细胞株的PCR产物配对上样，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳3～4 h。银染法显示PCR产物^［5］。从凝胶上切下差异条带， 进行PCR再扩增，扩增产物纯化后与pGEM-T载体连接，转化JM109感受态细胞，通过酶切鉴定和PCR筛选重组克隆。

　　3．差异片段的序列分析：采用ABI 373A全自动DNA序列分析仪，测定重组质粒中差异片段的核苷酸序列。从BLAST及EST基因库中查询差异片段的同源序列。

　　三、差异片段的鉴定

　　根据同源性分析结果，应用PCGENE软件设计合成引物（上海生工公司合成），采用RT-PCR鉴定差异基因在Skov3、Skov3/Taxol-25和其他耐药细胞中的表达。以621 bp的β-actin作内参。

　　结果

　　一、耐药细胞株的特性

　　Skov3在诱导过程中发生明显变化。 贴壁细胞呈不规则状，突起增多，胞浆出现空泡。 细胞生长迟缓，倍增时间延长。对泰素明显产生耐受。停止诱导后2个月，Skov3和Skov3/Taxol-25对泰素的IC₅₀分别为0.12 nmol/L±0.22 nmol/L和5.15 nmol/L±0.48 nmol/L。 Skov3/Taxol-25对泰素的RI为44.0，对顺铂产生交叉耐药，RI为6.1，但对阿霉素和足叶乙甙没有交叉耐药（图1）。

　　二、耐药相关基因的筛选

　　1．DD-PCR：分别用HT11M（M为G、C、A的一种）与8条随机引物配对进行PCR反应，每个样本行24个PCR。 银染显示条带如图2所示。每一对引物的PCR产物都有50～70个条带，Skov3和Skov3/Taxol-25的绝大多数条带的大小和染色深浅一致，说明两者表型相关，基因表达相似。仔细比较，发现两细胞间有22条不同的差异条带。

　　2．差异条带的再扩增和克隆：将切下的22条差异条带作为模板，用与其来源相同的引物进行PCR再扩增，其中18条得到大小与模板一致的特异性单一再扩增条带。对其中5条片段进行克隆，图3显示的是以重组质粒为模板的PCR鉴定结果。

　　3．cDNA片段的序列测定及同源性分析：对所克隆的5条差异片段进行了核苷酸序列分析。将DNA序列通过Internet在BLAST 数据库中查询并分析同源性。结果：1号片段99%(105/106)个碱基与组织型纤溶酶原激活物(t-PA)同源；3号片段97%（261/268）碱基与KIAA0372相同；18号片段99%（406/409）碱基与LDLC相同；14号和21号片段分别长558 bp和449 bp，为新的基因片段，已登录Genbank，登录号分别为AF120327和AF120328。

图1　泰素对Skov3和Skov3/Taxol25的剂量效应曲线

图2　RT-PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳银染显示差异条带

图3　差异条带PCR再扩增

　　三、差异片段的鉴定

　　从Genbank中分别查到tPA、KIAA0372和LDLC的基因序列，设计3对引物，对Skov3和Skov3/Taxol-25和其他耐药细胞系作RT-PCR。结果敏感细胞Skov3不表达tPA和Kiaa0372，而耐药株Skov3/Taxol-25和我们同时以Skov3建立的其他耐药细胞系都有tPA 和Kiaa0372表达。而敏感细胞和耐药细胞株中均有LDLC的表达。见图4，5。

M.Marker；N.阴性对照；1.Skov3；2.Skov3/Taxol-p；3.Skov3/Taxol-25；4.Skov3/CDDP-P；5.Skov3/CDDP50；6.Skov3/VP16；7.Skov3/Adr

4　RT-PCR检测tPA在耐药细胞系和亲本细胞系的表达

M.Marker；P.阳性质粒对照；N.阴性对照；1.Skov3；2.Skov3/Taxol-p；3.Skov3/Taxol-25；4.Skov3/CDDP-P；5.Skov3/CDDP50；6.Skov3/VP16；7.Skov3/Adr图5　RT-PCR检测Kiaa0372在耐药细胞系和亲本细胞系的表达

　　讨论

　　传统克隆耐药基因的方法是利用耐药细胞株制备单克隆抗体，但需耗费大量人力和物力。mRNA DD是一种分离表型相关基因的有效方法, 具有简便、灵敏、高效率和省时的优点，但假阳性高是其主要缺点^［2］。1998年Husain等^［6］采用mRNA DD研究卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3 CDDP/R，发现BRCA1基因的上调节与耐药有关。

　　本实验我们用泰素间歇诱导法建立了SKOV3/Taxol-25卵巢癌多药耐药细胞系，该细胞系不仅对泰素产生了耐药，而且对其它结构和作用机理不同的顺铂也产生了抵抗，耐药细胞的形态和细胞周期都发生了明显变化。这为我们用耐药细胞系Skov3/Taxol-25 和亲本细胞系Skov3作为差异筛选对象奠定了基础。应用建立的耐药细胞株Skov3/Taxol-25和亲本细胞株Skov3作DD-PCR ，发现22个差异表达条带。对其中5个进行了克隆和测序鉴定， 3个序列分别与已知的基因tPA、Kiaa0372和LDLC高度同源。2个序列为未知片段已登录Genbank。表明耐药细胞的生物学与基因水平的变化密切相关。

　　mRNA DD的主要缺点是假阳性高^［5］，所以鉴定工作非常重要。通常从测序胶中分离的差异条带都要经过Northern杂交来确定其真实性，但很难检测出丰度低的mRNA分子。我们用敏感的RT-PCR方法代替Northern 杂交。 结果发现，tPA 和Kiaa 0372在Skov3中无表达，在Skov3/Taxol-25中均有高表达， 而LDLC在Skov3及耐药株中都有表达，表达程度接近。提示tPA和Kiaa0372是Skov3产生耐药后表达的特异基因，而LDLC的差异片段是假阳性结果。tPA是一种特异性的丝氨酸蛋白水解酶，除了可以溶解凝血块，也参与肿瘤的侵袭转移^［7］。本研究中我们发现卵巢癌细胞株Skov3在获得耐药后tPA的表达增强，提示其降解细胞外基质的能力增强，更易发生转移。这可能是肿瘤获得耐药后预后较差的另一个原因。另一个已知基因Kiaa0372是从脑组织克隆得到的新基因，长5 704 bp，编码1 565个氨基酸残基组成的蛋白，但功能尚不明确。

　　作者单位：程国钧（100853 北京，中国人民解放军总医院妇产科)

　　李亚里（100853 北京，中国人民解放军总医院妇产科)

　　祝华（100853 北京，中国人民解放军总医院妇产科)

　　田方（中国人民解放军军事医学科学院)

　　李春海（中国人民解放军军事医学科学院)

　　王宏（中国人民解放军军事医学科学院)

　　杨秀玉（北京协和医院妇产科）

　　参考文献

　　1，Coukos G, Rubin SC. Chemotherapy resistance in ovarian cancer: new molecular perspectives, Obstet Gynecol, 1998,91:783-792.

　　2，Liang P, Pardee B. Differential display of eukarytic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992,257: 967-971.

　　3，Parekh , Wiesen K, Simpkins H. Acquisition of Taxol resistance via P-glycoprotein and non-p-glycoprotein-mediated mechanism in human ovarian carcinoma cells. Biochem Pharmacol, 1997,53:461-470.

　　4，Dieffendach CW, Dveksler GS. PCR技术实验指南.黄培堂，俞炜源，陈添弥，等，译.北京：科学出版社，1998.295-310.

　　5，Bassam B, Caetano G, Gresshof P, et al. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal Biochem, 1991,196:80-83.

　　6，Husain A, He GS, Venkatraman ES, et al. BRCA1 up-regulation is associated with repair-mediated resistance to cis-diamminedichloplatinum(II). Cancer Res, 1998,58:1120-1123.

　　7，Sheng S, Truong B, Fredrickson D，et al. Tissue-type plasminogen activator is a target of the tumor suppressor gene maspin. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95:499-504.