卵巢癌预定位放射免疫显像的实验研究

北京医科大学学报 1999年第4期第31卷 论著

作者：李小平　冯　捷　钱和年　付天云　庞　雁　朱殿清　高伯山

单位：李小平　冯　捷　钱和年　付天云　北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心；高伯山　核医学科，北京　100044；庞　雁　朱殿清　天津肿瘤医院核医学科

关键词：卵巢肿瘤；放射性核素成像；同位素标记；方法；抗体；单克隆

　　摘　要　目的：提高放射免疫显像(radioimmunoimaging, RII)质量, 建立卵巢癌预定位放射显像技术。方法：将合成的环二乙基三胺五乙酸(cyclic diethylenetriamine pentaacetic acid, cDTPA)与卵巢癌单抗COC183B₂进行偶联，Sephadex分离纯化后，采用免疫组织化学染色及细胞放射自显影对偶联物进行活性测定。将偶联的COC183B₂-cDTPA或 IgG分别经腹腔注入荷人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型体内，48 h后，将还原^99mTc淋洗液经腹腔注入体内，6 h后进行RII。显像后，体外称重并测量瘤及其他正常组织放射性活性，计算瘤与非瘤放射性比值（T/NT）。结果：(1) COC183B₂-cDTPA与浆液性卵巢癌组织免疫组化染色呈阳性；细胞放射自显影结果可见卵巢癌SKOV₃细胞膜周围呈环状显影，提示偶联后单抗仍保留了较好的免疫活性。（2） 注射还原^99mTc 6 h后RII, 可见实验组荷瘤裸鼠腹腔有特异放射性聚集；而对照荷瘤裸鼠腹腔无特异放射性聚集。实验组各器官T/NT值高于对照组，两者差异有显著性(P＜0.05)。结论：cDTPA偶联COC183B₂单抗进行卵巢癌预定位放射免疫显像简单、可行，有望应用于临床。

　　 中国图书资料分类法分类号　R737.31

The preliminary clinical study of pretargeted

　　radio-immunoimaging in ovarian carcinoma

LI Xiao-Ping^＃,　FENG Jie,　QIAN He-Nian, FU Tian-Yun,　PENG Yan, ZHU Dian-Qing， et al

　　(#Gynecologic Oncology Center, People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing　100044)

　　ABSTRACT　Objective: To establish the pretargeted radioimmunoimaging(RII) technique for improving the quality of RII in ovarian carcinoma.Methods: Monoclonal antibody COC183B₂ was conjugated with cyclic DTPA (cyclic diethylenetriamine pentaacetic acid) DTPA anhydride and its immunoactivity was measured by PAP staining or autoradiography in vitro. COC183B₂-cDTPA or normal mouse IgG (NMIgG) were respectively injected intraperitoneally (i.p.) into two groups of nude mice bearing human ovarian carcinoma with ascites.48 hours later, reduced　^99m　Tc was injected i.p. again. RII was performed 6 hours later. After RII, the γ counting of related tissues was measured to calculate the ratio of radioactivity for tumor and non-tumor (T/NT).Results: (1) The coupled COC183B₂　showed good immunoactivity by PAP staining and autoradiography.　(2) 6 hours after

　　^99m　Tc administration, RII showed clear localization of tumor and T/NT ratios were significantly higher than those of the control group.Conclusion: Monoclonal antibody COC183B₂ coupled by cDTPA used for pretargeted RII is practical, hopefully to be used clinically in ovarian carcinoma.

　　MeSH　Ovarian neoplasms/radionuclide　　Isotope labeling/methods　　Antibodies, monoclonal

　　近年来随着核技术的改进及显像技术的发展，采用单克隆抗体进行放射免疫显像为卵巢癌诊断开辟了新途径，但仍存在许多亟待解决的问题，限制了该技术的临床应用。预定位技术的原理即将抗体先注入体内同肿瘤结合，待体内未结合的抗体排出体外，再注入放射性核素，可提高T/NT值，减低本底，同时简化标记。有关卵巢癌预定位放射免疫显像的报道国内、外较少，本研究旨在为临床应用提供基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　环二乙基三胺五乙酸酐(cDTPA)的制备

　　取二乙基三胺五乙酸粉末(DTPA, Sigma公司)400 mg,乙酸酐0.8 ml,吡啶0.5 ml, 放入棕色瓶内进行反应，66～67　℃反应24 h，所得的白色粉末即为cDTPA^［1］。

　　1.2　抗卵巢癌单抗COC183B₂与cDTPA的偶联、分离及纯化

　　取COC183B₂(10 g·L^－1)0.5　ml^［2］, cDTPA、DMSO(二甲基亚砜) 20　μl(10　g·L^－1),缓冲液为NaHCO₃(pH 8.2),反应24～26 h，得抗体与DTPA偶联物。采用SephadexG75柱对COC183B₂-cDTPA进行分离，淋洗液为PBS　0.2　mol·L^－1(含0.5　mol·L^－1 NaCl)。收集各管洗脱液，并用紫外线核酸蛋白检测仪(波长280　nm)测定其蛋白含量，绘出淋洗曲线，首峰即COC183B₂-cDTPA 蛋白峰。采用免疫组织化学染色(PAP法)进行偶联单抗的活性测定。

　　1.3　细胞放射免疫自显影

　　将培养的卵巢癌细胞SKOV₃(ATCC) 进行分离，调细胞浓度为1×10⁷　ml^－1，取COC183B₂-cDTPA(1 g·L^－1) 0.01　mg与还原的^99mTc (7.4×10⁸　Bq·ml^－1) 3.7×10⁶ Bq 在室温下混合,37　℃保温120 min后，生理盐水冲洗3次，将细胞吹散，滴加在滤纸上，覆盖一层保鲜膜。在暗室中压X光胶片，－20　℃曝光48 h后读片。

　　1.4　荷人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型的建立^［3］

　　取卵巢癌细胞株SKOV₃,调节细胞浓度1×10⁷　ml^－1,注入雌性、4～6周BALB/c裸鼠皮下形成皮丘。每只裸鼠注射2～4点，每点6×10⁶个细胞。待皮下移植瘤直径约为0.5～1.0　cm后，再次将已形成的皮下瘤剪成1　mm³块注入裸鼠腹腔。待腹腔触摸到大小不等的瘤结节时备用。

　　1.5　预定位放射免疫显像

　　将腹水瘤裸鼠随机分为2组，每组3只。分别经腹腔注入COC183B₂-cDTPA 或正常鼠IgG（每只0.25 mg）进行预定位，48 h后,经腹腔注入还原的^99mTc 2.59×10⁷ Bq (7.4×10⁸　Bq·ml^－1)。6 h后采用Sophy NXT γ照相机及通用型平行孔准直器进行显像。显像后即刻处死荷瘤鼠，依次取下肝、脾、肠、肌肉及肿瘤称重并用井型探测仪进行放射性计数，计算单位重量放射性计数(cpm)及T/NT值。

　　1.6　数据处理及统计分析

　　计量资料采用t检验以±s表示。

　　2　结果

　　2.1　COC183B₂-cDTPA偶联物免疫组化染色及细胞放射自显影

　　偶联物COC183B₂-cDTPA与浆液性卵巢癌组织免疫组化染色呈阳性结果，卵巢癌细胞膜呈棕色；细胞放射自显影结果可见卵巢癌SKOV₃细胞膜周围呈环状显影，提示COC183B₂与cDTPA偶联后，保留了较强的与卵巢癌细胞结合的活性，显示该偶联单抗用^99mTc标记后仍保留了较好的免疫活性。

　　2.2　预定位放射免疫显像

　　注射^99mTc 6 h后, SPECT扫描显示实验组荷瘤裸鼠腹腔有特异放射性聚集，且放射性本底较低；而对照荷瘤裸鼠腹腔无特异放射性聚集。显像后井型探测仪测定各器官的T/NT值见表1，由表1可见T/NT值实验组明显高于对照组，两者差异有显著性(P＜0.05)。

表1　显像后两组荷瘤鼠各器官T/NT值(±s)

　　Table 1　T/NT value of two groups of nude mice after RII(±s)

　　*P＜0.05,compared with control value．

　　3　讨论

　　近年来随着高亲和力的单抗制备及标记技术的改进，放射免疫显像已成为热门的研究课题。卵巢癌RII始于80年代，其敏感性高，特别是对盆腔内肿瘤的诊断优于B超、CT及MRI。但仍存在许多亟待解决的问题，如T/NT值低，本底高，标记操作繁琐等。临床应用中为减少本底，提高图像清晰度和探测效率，有不少方法如相减术、脂质体、第二抗体和标记片段等被采用，但效果并不令人满意。此外药代动力学研究还表明标记的抗体在肿瘤及正常组织内清除较慢，不利于短半衰期核素的应用。但是^99mTc具有良好的物理性能(T_1/2=6　h,E=140　keV),如何更好应用到RII是值得研究的问题。

　　预定位放射免疫显像技术是首先将特异的已与金属螯合物cDTPA偶联单抗（第一交联物）注入体内，待其与肿瘤结合，血清中未结合单抗被代谢或排出，正常本底降低后，再注入核素（第二交联物），核素通过与DTPA间强的络合力，与已定位的肿瘤单抗结合，达到显像的目的。由于抗体在体内与核素发生结合反应，抗体与核素分别给药，抗体先注入体内，可延长抗体在肿瘤细胞上的滞留时间，待抗体与肿瘤细胞充分结合，余未被结合的抗体大部分被排出体外，肿瘤结合抗体与正常组织未结合抗体达最大比值，再注入核素，进行体内标记，可明显提高肿瘤/非肿瘤放射性比值和降低放射性本底，同时使短半衰期的核素应用成为可能。

　　^99mTc标记抗体的方法分直接法与间接法两种。间接法多采用EDTA、DTPA及其衍生物。DTPA与重金属有较强的络和力，而DTPA有较强的共价键,可结合到IgG抗体分子上^［4］。采用DTPA进行预定位RII时，将偶联cDTPA单抗预先注入患者体内，一定时间后聚集在肿瘤部位，再注入还原核素后，在体内进行标记，最终达到肿瘤显像目的。国内庞雁等^［1］经静脉注射¹¹¹In-DTPA标记CEA进行结直肠癌预定位技术RII临床应用，取得较满意结果。

　　本研究采用cDTPA偶联卵巢癌单抗COC183B₂首先进行体外实验，结果显示此偶联卵巢癌单抗保留较好的免疫活性。预定位RII，注射cDTPA偶联卵巢癌单抗COC183B₂ 48 h后，再注入核素^99mTc，6 h后进行显像，结果可见实验组荷瘤裸鼠腹腔有特异放射性聚集，且放射性本底低；而对照荷瘤裸鼠腹腔无特异放射性聚集。显像后处死裸鼠，测定的两组各器官T/NT相比，实验组明显高于对照组T/NT值(P＜0.05) ，提示偶联卵巢癌单抗进行预定位放射免疫显像是可行的。

　　预定位放射免疫显像技术不仅可降低本底，提高T/NT值，改善显像质量，而且标记物在血循环滞留时间缩短，显像时间提前，因此可降低给药剂量，减少对肝及骨髓的损伤; 另外预定位技术可使用短半衰期核素， 简化核素标记，易于临床操作，且有望使显像试剂药盒化。1992年美国FDA批准¹¹¹In标记的抗CEA单抗、B72.3药盒、Oncoscint cR/OV药盒进行临床应用。但有关卵巢癌放免显像药盒制备国内未见报道。

　　本室采用自制卵巢癌单抗，已进行RII实验研究及临床应用，特异性达89.7%,敏感度达90.7%，效果较满意。本研究进一步建立卵巢癌预定位放射免疫显像技术，可简化RII操作，减低放射性本底，有望研制卵巢癌诊断试剂盒，为临床推广应用提供帮助。

　　参考文献

　　1　庞　雁,牛瑞芳,常克力,等. DTPA放射免疫显像预定位技术的建立及其应用. 中国肿瘤临床，1996,23:609

　　2　Qian HN, Feng J, Gao BS, et al. Clinical evaluation of radio-immunoimaging with　¹³¹Ⅰ-COC183B₂ monoclonal antibody against ovarian carcinoma by intraperitoneal injection. Gynecol Oncol, 1992,47:216

　　3　李文锦，钱和年，吕文英，等.人卵巢上皮性癌裸鼠皮下移植肿瘤模型和腹水瘤模型的建立. 中华妇产科杂志,1993,28(1):38-40

　　4　Childs RI,Hnatowich DJ. Optimum conditions for labeling of DTPA-coupled antibodies with Technetium-99M. J Nucl Med, 1985,26(3):293-299

(1998-08-28收稿)