免疫重建荷人卵巢癌-严重联合免疫缺陷小鼠模型的建立

北京医科大学学报 2000年第6期第32卷 妇产科学研究

作者：崔恒　李艺　童春容　成夜霞　冯捷　刘蓓　葛华　钱和年

单位：北京大学人民医院妇科肿瘤中心，北京　100044

关键词：免疫缺陷综合征；治疗；卵巢肿瘤；治疗；免疫疗法；疾病模型；动物

　　［摘　要］目的：为研究卵巢癌的免疫治疗方法构建合适的动物模型。方法：严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠皮下接种人卵巢癌细胞系SKOV₃，同时腹腔注射人脾或外周血淋巴细胞进行免疫功能重建。观察成瘤情况；并用ELISA法检测鼠血清中人IgG含量以及流式细胞学和ABC免疫组织化学法测定鼠脾内人T细胞表型鉴定免疫重建。结果：免疫重建的小鼠成瘤率为89.6%，免疫组化证实皮下瘤保持原细胞系特征。3种方法检测发现用人外周血淋巴细胞免疫重建的效果优于用脾淋巴细胞。结论：免疫重建的荷人卵巢癌-SCID小鼠模型已初步建立成功。

　　［中图分类号］R979.5-332　　［文献标识码］A

　　［文章编号］1000-1530（2000）06-0488-04

The study of reconstitution of human ovarian carcinoma-severe combined immunodeficiency mice model

CUI Heng,LI Yi,CHENG Ye-Xia,FENG Jie,LIU Bei,GE Hua,QIAN He-Nian

　　(Gynecologic Oncology Center)

　　TONG Chun-Rong

　　(Institute of Hematology,Peking University People's Hospital,Beijing　100044，China)

　　ABSTRACT　Objective:To establish an adequate experimental animal model for the development of immunotherapeutic strategies of ovarian carcinoma.Methods:Human ovarian cancer cell line SKOV₃ was administrated subcutaneously in severe combined immunodeficiency (SCID) mice,which was reconstituted by human lymphocytes from spleen or peripheral blood.The tumor growth was observed.Human immunoglobulins in mouse serum were assayed by ELISA,and human T cells in murine spleen were evaluated by flow cytometry and immunohistologic stainings respectively.Results:　The rate of the reconstituted mice was 89.6%.Immunohistologic stainings showed that the subcutaneous tumors still had the characteristics of ovarian adenocarcinoma.The results illustrated that peripheral blood lymphocytes were better than spleen cells in the reconstitution.Conclusion:The reconstituted SCID mouse model with human ovarian cancer cell line has been established successfully.

　　KEY WORDS　Immunologic deficiency syndromes/ther;Ovarian neoplasms/ther;Immunotherapy;Disease models,animal

　　卵巢癌的发病率在妇科恶性肿瘤中占第2位，但其死亡率却居首位^［1］，目前所用的常规治疗方法(包括手术、化疗和放疗)难以提高其5年生存率。因此，生物治疗（特别是其中的免疫治疗）作为肿瘤治疗的第四大模式日趋重要。为进一步研究卵巢癌的生物学行为，寻找新的、更有效的免疫治疗方法，需要一个合适的实验动物模型。合适的动物模型应既可携带人类肿瘤，又具有正常的人类免疫功能。目前常用的裸鼠动物模型难以达到此要求,而利用严重联合免疫缺陷 ( severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠构建荷人卵巢癌模型并进行人免疫功能重建国内尚未见报道，国外近年来仅见个别报道^［2,3］。本文在这方面作了尝试并获得初步成功。

　　1　材料与方法

　　1.1　动物、细胞系及试剂

　　SCID小鼠：雌性，6～8周龄，购自中国医学科学院动物所，按三级动物要求，饲养在无特定病原体环境中，所用食料、饮水、笼具及垫料均经高压灭菌。

　　人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV₃中高分化，来自美国 ATCC 。

　　主要抗体：生物素标记兔抗鼠IgG 及辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记亲和素购自美国Dako公司；羊抗人IgG 及HRP标记羊抗人IgG购自北京帮定公司；小鼠抗人CD3、CD4、CD8单克隆抗体及异硫氰基荧光素标记羊抗小鼠IgG购自北京中山生物公司；COC166-9由本室自制，是抗卵巢浆液性乳头状囊腺癌抗原OC166-9的单克隆抗体；小鼠IgG及人IgG购自北京帮定公司。

　　1.2　SCID小鼠“渗漏”的筛查

　　小鼠均从眼内眦取血，离心得血清（待测样品）。采用生物素-亲和素夹心ELISA 法，以小鼠IgG纯品作标准曲线；羊抗小鼠IgG包被ELISA板，依次加入待测血清、生物素标记兔抗鼠IgG及HRP标记亲和素孵育,OPD显色,测490 nm的光密度。小鼠血清IgG小于1 mg·L^－1者为非“渗漏”型，供实验用。

　　1.3　实验分组及模型构建

　　34只非“渗漏”SCID小鼠皮下接种SKOV₃细胞，每只接种3～4点，每点每0.2 ml PBS约(0.7～1.2)×10⁷细胞，随机分为3组：(1)第1组，9只作为对照组，不进行免疫重建；(2)第2组，15只，每只腹腔注射人脾来源的淋巴细胞30×10⁶～40×10⁶每0.5　ml　PBS进行免疫重建，其中5只从重建2周起，每周处死1～2只小鼠，取脾进行鉴定；（3）第3组，10只，其中用供者1来源的外周血淋巴细胞重建7只，用供者2 来源的重建3只，方法及细胞数量同第2组。

　　1.4　小鼠皮下移植瘤特征鉴定

　　SCID小鼠皮下移植瘤组织经10%(质量分数)福尔马林固定，石蜡包埋切片。（1）HE染色，显微镜下常规形态学观察；（2）ABC免疫组化染色（一抗为COC166－9，二抗为生物素标记兔抗鼠IgG，三抗为HRP标记亲和素），显微镜下观察其是否保留了原细胞系的特征。

　　1.5　SCID小鼠免疫重建的鉴定

　　1.5.1　鼠血清中人 IgG含量的测定　定期从免疫重建的SCID 小鼠眼内眦取血，离心得血清。以羊抗人IgG包被ELISA板，以人IgG纯品作标准曲线；依次加入血清和HRP-羊抗人IgG，OPD显色，测490 nm的光密度。

　　1.5.2　鼠脾内人T细胞的检测　（1）流式细胞学鉴定：在免疫重建的SCID小鼠死亡当天取脾，机械研磨后过200目筛网，并用淋巴细胞分离液常规分离获得脾淋巴细胞悬液。以正常人外周血淋巴细胞为阳性对照，以未重建的SCID小鼠脾细胞为阴性对照，采用流式细胞仪作T细胞表型分析。（2）免疫组化检查：取重建后SCID小鼠的脾脏，以 ABC免疫组化染色(一抗为小鼠抗人CD3单抗，其余方法同1.4)，显微镜下观察。以未重建SCID小鼠的脾为阴性对照。

　　1.6　统计学处理

　　数据以±s表示，小鼠成瘤率采用χ²检验，小鼠生存期采用t检验，用SPSS软件处理。

　　2　结果

　　2.1　SCID小鼠“渗漏”的筛查

　　共检测了41只6～8周龄小鼠，其中40只的光密度在0.1～0.3之间，IgG质量浓度为（0.24±0.16）mg·L^－1；只有1只小鼠IgG质量浓度为2.3 mg·L^－1，渗漏比例为2.4%。

　　2.2　人卵巢癌细胞系SKOV₃-SCID小鼠移植

　　2.2.1　成瘤潜伏期和成瘤率　9只未免疫重建的小鼠和20只免疫重建的小鼠(除去第2组中从重建2周起定期处死的5只)，成瘤潜伏期均为14～17 d，成瘤率分别为31/34和69/77。经χ²检验，二组差异无显著性(P＞0.05)。

　　2.2.2　小鼠生存期　9只未重建的小鼠平均生存期为(50±16)d，20只重建的小鼠平均生存期为(35±11)d，经t检验,二组差异有显著性(P＜0.01)。

　　2.2.3　小鼠皮下移植瘤特征　SCID小鼠皮下瘤结节HE染色呈典型腺癌 结构，用COC166－9 ABC染色阳性，可见细胞膜、细胞浆有明显的棕色染色。

　　2.3　SCID小鼠免疫重建的鉴定

　　2.3.1　鼠血清中人IgG含量的测定　第2组用脾淋巴细胞重建的15只SCID小鼠，有4只可以检测到人IgG的存在，但其含量很低，只有微克级,在免疫重建后23、30、37和46 d鼠血清中人IgG水平分别为2.53、3.93、5.40和9.33 mg·L^－1。第3组用人外周血免疫重建的10只SCID小鼠，100%可以检测到人IgG的存在，其含量达到毫克级(表1)。以上二组小鼠血清中人IgG含量均随重建时间的延长而升高。对照组未检测到人IgG的存在。

　　2.3.2　鼠脾内人T细胞的检测　用流式细胞学检测第2组用人脾淋巴细胞重建的15只SCID小鼠，有6只（40%）阳性。第3组用人外周血淋巴细胞重建的10只小鼠只检测了2只均阳性。对照均为阴性(图1)。用ABC免疫组化方法在上述免疫重建成功的SCID小鼠脾内可查见人CD3^＋细胞，其细胞膜有明显的棕色染色。而未免疫重建的SCID小鼠脾为阴性。

表1　人外周血淋巴细胞免疫重建后鼠血清中人IgG水平

　　Table 1　Human IgG in mouse sera after reconstituted

　　with human peripheral blood lmyphocyte

　　ρ/(g·L^－1)

　　t,time,ρ,mass concentration.3　讨论

　　SCID小鼠是1983年Bosma首次报道的一种以细胞和体液严重联合免疫缺陷为特征的近交系小鼠。已广泛应用于肿瘤学、免疫学、寄生虫学、病毒学等方面的研究。目前已有大量人类肿瘤移植到SCID小鼠的报道，并证实SCID小鼠比裸鼠更适合于众多人类肿瘤生长、转移的研究。同时SCID小鼠可以用人类的有关细胞进行免疫功能重建，适合于在动物体内研究人类免疫细胞和人类肿瘤的关系，是极佳的活体测试系统^［4］。

　　目前荷人卵巢癌-裸鼠皮下瘤及腹水瘤模型国内外均已成功建立。本中心魏丽惠等^［5］在国内率先制备成功荷人卵巢癌的裸鼠模型，在进行实验性化疗及放射免疫显像的研究中起了重要作用。但由于裸鼠仍具有体液免疫功能，不是研究免疫治疗方法体内验证的理想模型。而SCID小鼠既可携带人类肿瘤，又可用人类淋巴细胞进行免疫功能重建，因此有可能是较理想的免疫治疗方法临床前实验的动物模型。近年来，国外已有个别关于用SCID小鼠重建人免疫系统和移植人卵巢癌成功的报道^［2,3］，但国内尚未见相关报道。本文构建免疫重建荷人卵巢癌-SCID小鼠模型,取得成功。

　　在用SCID小鼠进行肿瘤或免疫学实验研究时,为了避免小鼠自身免疫功能的影响，通常用ELISA法测定鼠血清中总Ig含量来判断小鼠是否渗漏。一般要求鼠Ig质量浓度小于1 mg·L^－1用作实验。“渗漏型”(leaky-phenotype) SCID小鼠具有低水平的功能性B细胞和T细胞。 “渗漏”出现的频率 及产生免疫球蛋白的水平，与鼠龄及饲养环境的控制有关。在SPF屏障系统中饲养的SCID小鼠，3～9月龄中检出Ig 阳性的小于5%，12～15月龄中至少30%检出Ig阳性。“渗漏”型小鼠的Ig水平为1～5 mg·L^－1［6］，由于IgG占总Ig的80％以上，故本文只测定IgG含量。结果证实用生物素-亲和素夹心ELISA法对SCID小鼠“渗漏”进行初筛，简便、敏感、可行。

图1　SCID小鼠脾细胞流式结果

　　Figure 1　Flow cytometry of spleen of SCID mice

　　SKOV₃细胞属于中高分化的卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株，其恶性程度、转移力相对较低；本文借鉴了该细胞系在裸鼠皮下移植的经验^［7］，均选用进入对数生长期的SKOV₃细胞，适宜的细胞数量和浓度进行皮下接种，并严格控制实验环境，因此获得了较高的成瘤率。

　　文献报告影响免疫重建效果的因素主要有：(1)SCID小鼠的个体差异。(2）SCID小鼠重建前的预处理。在重建前用Υ射线全身外照射和/或注射抗鼠NK细胞的单抗可获得短期内更好的重建效果。(3）供者因素。的个体差异使重建效果不同，同一供者的不同组织重建效果也不同。(4）淋巴细胞重建的途径经静脉途径无法重建，而腹腔注射可很好地重建。(5）淋巴细胞重建的数量。一般认为(30～40)×10⁶重建效果好，细胞过少难以达到重建效果，细胞过多又易引起移植物抗宿主疾病。(6）宿主抗移植物反应和移植物抗宿主疾病。

　　本文中免疫重建后的SCID小鼠平均寿命短于未重建组，考虑主要与移植物抗宿主反应有关。Sandhu等^［8］报道移植物抗宿主疾病（graft versus host disease,GVHD）几乎使所有的小鼠在移植后28 d内死亡。他们认为引起GVHD的机制主要有以下3个：人CD4⁺的T淋巴细胞、人抗鼠抗体的作用、人淋巴细胞因子的作用。

　　本文采用2种来源的人淋巴细胞进行免疫重建，即脾和外周血。结果发现：(1）用2位供者的外周血重建的10/10只SCID小鼠血清均可测到人IgG存在，且含量达到毫克级，与文献报告相符^［6］。同时也注意到人的差异使重建效果不同，用供者2的PBMC重建后SCID小鼠血中人IgG含量显著高于供者1。Hesselton等^［6］报告用51位供者重建了1　800只SCID小鼠，其成功率在62%～100%之间。Shpitz等^［9］用5位供者重建约20只小鼠，12～14　d后鼠脾内人CD3⁺细胞为23.4%～57.2%之间。(2）用脾淋巴细胞重建4/15只（26.7 %）SCID小鼠血清可测到人IgG存在，但含量仅微克级，远低于用外周血重建者。Hesselton等^［6］的实验中,10/10例用人脾淋巴细胞重建的SCID小鼠均可产生Ig,但未报告具体数值；Smith等^［10］用人脾淋巴细胞重建的SCID小鼠均未测到Ig。本文结果介于二者之间。

　　人脾淋巴细胞免疫重建的荷人卵巢癌细胞SKOV₃-SCID小鼠模型免疫重建成功率较低（26.7％），是否适合于卵巢癌免疫治疗的研究尚需进一步探索。而人外周血淋巴细胞免疫重建的荷人卵巢癌细胞系SKOV₃-SCID小鼠模型成瘤率高(89.6%)，免疫重建成功率高(100％)，我们利用这种模型正进行卵巢癌抗独特型疫苗的体内实验研究，初步结果令人鼓舞（另文发表），提示其有可能成为卵巢癌免疫治疗研究的较理想模型。

　　参考文献

　　1，Daly M,Obrams I.Epidemiology and risk assessment for ovarian cancer［J］.Semin Oncol，1998,25:255-264

　　2，Walker W,Gallagher G.The development of a novel immunotherapy model of human ovarian cancer in human PBL-severe combined immunodeficient(SCID)mice［J］.Clin Exp Immunol，1995,101:494-501

　　3，Schumscher U,Adam E,Horny HP,et al.Transplantation of a human ovarian cystadnocarcinoma into severe combined immunodeficient(SCID) mice-formation of metastases without significant alteration of the tumour cell phenotype［J］.Int J Path，1996,77:219-227

　　4，Tary-Lehmann M,Saxon A,Lehmann PV.The human immune system in hu-PBL-SCID mice［J］.Immunol Today，1995,16:529-533

　　5，魏丽惠，李自新，虞　幸，等.人卵巢癌裸鼠移植瘤传代生长的观察研究［J］.中华妇产科杂志,1989,24:32-34

　　6，Hesselton RM,Koup RA,Cromwell MA,et al.Human peripheral blood xenografts in the SCID mouse:characterization of immunologic reconstitution［J］.J Infect Diseas，1993,168:630-640

　　7，李文锦，钱和年，吕文英.人卵巢上皮癌裸鼠皮下移植瘤模型和腹水瘤模型的建立［J］.中华妇产科杂志，1993,28:38

　　8，Sandhu J,Shpitz B,Gallinger S,et al.Human primary immune response in SCID mice engrafted with human peripheral blood lymphocytes［J］.J Immunol，1994,152:3806-3813

　　9，Shpitz B,Chambers CA,Singhal AB,et al.High level functional engraftment of severe combined immunodeficient mice with human peripheral blood lymphocytes following pretreatment with radiation and anti-asialo GM1［J］.J Immunol Meth，1994,169:1-15

　　10，Smith CIE,Abedi MR,Islam KB,et al.Humoral immunity in SCID mice reconstituted with cells from immunoglobulin-deficient or normal humans［J］.Immunol Rev，1991,124:113-137

收稿日期：1999-08-25