米非司酮对人卵巢癌细胞系HO－8910的生长及细胞周期的影响

中国肿瘤临床 2000年第5期第27卷 论著

作者：孙丽君　刘慧范　郭海洲　郑英

单位：孙丽君（河南医科大学第二附属医院　郑州市450003）；刘慧范（河南省许昌市妇幼保健院妇产科）；郭海洲（河南医科大学第二附属医院　郑州市450003）；郑英（河南医科大学第二附属医院　郑州市450003）

关键词：米非司酮；卵巢肿瘤；Ki－67抗原；免疫组化；流式细胞术

　　摘要　目的：探讨米非司酮对人卵巢上皮性癌细胞的 杀伤活性及对细胞增殖和细胞周期分布的影响。方 法：采用MTT测定，观察不同浓度米非司酮（20、10、5、 2.5μmol/L）对HO－8910细胞的杀伤活性；通过ABC免疫组化 染色及流式细胞仪分析，检测用药后HO－8910细胞Ki－67抗 原表达、细胞周期分布及细胞增殖指数的变化。结 果：4个浓度的米非司酮对HO－8910细胞均有杀伤作用， 并呈剂量依赖性，以20μmol/L浓度杀伤作用最明显，杀 伤率达52.01％；5μmol/L米非司酮可使HO－8910细胞Ki－67抗 原表达显著减少，细胞增殖受到明显抑制，使细胞 阻滞于G0/G1期，不能进入S及G2/M期，细胞增殖指数明显 下降。结论：米非司酮体外对人卵巢上皮性癌细胞 具有杀伤活性，并对细胞增殖及细胞周期有明显抑 制作用，主要通过抑制DNA合成，将细胞阻滞于G0/G1期 。

Effects of Mifepristone on Cell Proliferation and Cell Cycle Kinetics of Human Ovarian Epithelial Carcinoma Cell Line HO－ 8910 in Vitro

Sun Lijun Liu Huifan Guo Haizhou（Second Hospital of Henan Medical University, Zhengzhou）

　　Abstract Objective: To study the effects of mifepristone on cell proliferation and cell cycle kinetics of human ovarian carcinoma cell lines HO－ 8910 in vitro. Methods: The antiproliferation effects of four different concentrations of mifepristone (20,10,5,2.5μ mol/L) on HO－ 8910 cell line were determined with MTT assay. Immunohistochemical (ABC) and flow cytometry techniques were used to determine the changes of Ki－ 67 antigen expression and cell cycle distribution and cell proliferation index after treatment with mifepristone. Results: Four different concentrations dose－ dependently inhibited the proliferation of HO－ 8910 cells. The inhibition by mifepristone plateaued at 20μ mol/L (52％ inhibition). Mifepristone at 5μ mol/L decreased the expression of Ki－ 67 antigen of HO－ 8910 cells. It (5μ mol/L) caused a decline in the proportion of cells in S and G2/M phase, blocked the cell cycle progression in G0/G1 phase and reduced the proliferation index (PI) of HO－ 8910 cells. Conclusion: In vitro, Mifepristone significantly inhibites the growth of human ovarian epithelial carcinoma cells which are progestin receptor positive and leads to arrest of the cell cycle progression in G0/G1 phase.

　　Key Words Mifepristone Ovarian neoplasm Immunohistochemistry Ki－ 67 antigen Flow cytometry

　　性激素与某些肿瘤的发生发展有密切关系，利用性 激素间相互抑制及拮抗作用治疗某些激素依赖性肿 瘤，副作用小，毒性低，尤其对一些复发及耐药病 例也有一定疗效，因而越来越受到临床的关注。米 非司酮（mifepristone,又名RU486）系人工合成的类固醇激素 ，为强效受体水平的孕激素及糖皮质激素拮抗剂，临床主要应用于药物流产，疗效肯定 ，且无明显毒副作用。近年来许多研究结果表明， 其对某些孕激素受体(PR)阳性的肿瘤如乳腺癌、脑膜 瘤、子宫肌瘤等均有抑制作用^[1～3]，但有关米非司 酮对卵巢癌的作用报道甚少。本研究采用MTT测定、免 疫组化及流式细胞仪分析，体外观察米非司酮对卵 巢上皮性癌细胞HO－8910的杀伤作用及对细胞增殖和细 胞周期的影响。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1细胞系人卵巢浆液性囊腺癌细胞系HO－8910，由中 科院上海细胞生物学研究所提供。

　　1.1.2药物与试剂RPMI1640培养基，美国Gibco公司生产；四 氮甲唑蓝(MTT)及碘化丙啶(PI)均为美国Sigma公司产品；Ki－ 67多克隆抗体，美国Zymed公司产品；ABC抗兔IgG免疫组化 试剂盒，购于华美公司；RNA酶，上海奥伯生物科技公 司产品；米非司酮，上海华联制药厂提供。

　　1.1.3主要仪器DG3032酶联免疫检测仪，南京光学仪器厂 生产；FACstar流式细胞仪，美国B.D公司生产。

　　1.2　方法

　　1.2.1细胞培养人卵巢癌HO－8910细胞用含10％胎牛血清 的RPMI1640培养液（含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml），37℃ ，5％二氧化碳恒温培养箱内培养。取对数生长期细 胞，以1×10⁵/ml接种于96孔培养板中，24小时后换培养液 ，分为用药组及对照组。用药组培养液中加入无水 乙醇溶解的米非司酮，终浓度分别为20、10、5、2.5μ mol/L，乙醇浓度≤0.2％(V/V)，对照组培养液中含0.2％(V/V)的 乙醇，继续培养4天后进行MTT测定。

　　1.2.2MTT测定参照温汉平法^[4]，经酶联免疫检测仪测用 药组及对照组A570值。杀伤率=(1－实验组A570/对照组A570值 ）×100％。

　　1.2.3ABC免疫组化法检测Ki－67抗原取对数生长期的HO－ 8910细胞5ml(1×10⁴/ml)接种于100ml培养瓶中，分用药组(5μ mol/L)及对照组，每组各做3瓶。4天后用0.25％胰酶消化 ，RPMI1640漂洗3次，制成细胞涂片。每瓶取3张涂片，冷 丙酮4℃固定15分钟，按常规方法行ABC免疫组化染色。 封片后在显微镜下观察结果，高倍镜计数500个细胞内 Ki－67抗原阳性细胞的百分率。Ki－67阳性细胞均为核 着色，表现为核浆呈棕黄色或出现许多棕色小颗粒 或呈网状，见附图。

附图　对照组HO－8910细胞Ki－67抗原的表达定位于胞核, 核浆呈棕黄色或出现棕色小颗粒

　　aBC免疫组化显色细胞涂片×400

　　1.2.4流式细胞仪分析在规定时间内离心收获对照组 及用药组(5μmol/L,2.5μmol/L)细胞达1×10⁶个，加冷PBS洗涤2次 ，70％冷乙醇固定，4℃保存。测定时离心弃乙醇，PBS洗 涤2次，RNA酶(0.1mg/ml)37℃消化30分钟，PI染色(50mg/ml),15分钟 后上机测试，打印出DNA含量分布组方图，自动拟合出 细胞周期各时相比例，以下列公式计算增殖指数（ Proliferation Index,PI）:PI=(S＋G₂/M)/(G₀/G₁＋S＋G₂/M)×100％。

　　1.2.5统计学处理经SAS统计软件包处理，分别采用q检 验及t检验，以P＜0.05为有显著性差异。

　　2　结果

　　2.1　米非司酮对HO－8910细胞杀伤活性的测定(MTT法)

　　见表1。

表1　不同浓度米非司酮对HO－8910细胞的 杀伤活性(MTT法)

分组	A570(±s)	杀伤率(％)
2.5μmol/L	0.9158±0.0371*	12.86
5μmol/L	0.8050±0.0460*	23.33
10μmol/L	0.6781±0.0683*	35.48
20μmol/L	0.5044±0.0579*	52.01
对照组	1.0510±0.0451**	-

　　q检验　*与对照组比较P＜0.001

　　**对照组与各组间两两比较P＜0.001

　　以上结果表明，上述4个浓度的米非司酮对HO－8910细 胞均有杀伤活性，10μmol/L的浓度即可表现出明显的杀 伤力，20μmol/L的浓度杀伤作用最强，杀伤率达52.01％， 且随药物浓度的增加，作用加强，呈剂量依赖性关 系。

　　2.2　米非司酮对HO－8910细胞Ki－67抗原表达的影响

　　见表2。

表2　米非司酮对HO－8910细胞Ki－67抗原表达的影响

组别	样本号	Ki－67阳性率(％)	平均值(±s)
用药组	1	65.14	66.21±3.02
	2	69.62
	3	63.88
对照组	1	83.60	81.17±
	2	79.46
	3	80.47

　　t检验两组比较0.02＜P＜0.05

　　免疫组化结果表明，5μmol/L米非司酮与HO－8910细胞作 用4天后，HO－8910细胞Ki－67抗原表达明显减少，与对照 组比较差异有显著性（P＜0.05）。

　　2.3　米非司酮对HO－8910细胞增殖周期的影响

　　见表3。

表3　米非司酮对HO－8910细胞增殖周期的影响

　　流式细胞仪(FCM)检测结果表明，上述两个浓度的米 非司酮与HO－8910细胞作用12小时，细胞增殖周期无明 显变化，24小时时G₂/M期细胞比例下降，作用48小时时S期 细胞也明显下降，细胞被阻滞于G₀/G₁期，PI明显降低。

　　3　讨论

　　米非司酮抗肿瘤的作用机制不清，一般认为PR阳性 为其作用前提^[5]。卵巢恶性肿瘤中，上皮性卵巢癌发 病率最高，且表达丰富的ER、PR，故我们选择PR阳性的 人卵巢浆液性囊腺癌细胞系HO－8910为实验细胞，体外 观察米非司酮对该细胞的作用。根据口服米非司酮 药物流产时的血药浓度，选择2.5、5、10、20μmol/L为实 验用药浓度。MTT测定发现上述4个浓度的米非司酮对HO－ 8910细胞均有杀伤活性，杀伤率分别为12.86％、23.33％、 35.48％、52.01％，10μmol/L组即可表现出较明显的杀伤作 用，且随药物浓度的增加作用加强，呈剂量依赖性 关系。

　　Ki－67抗原为增殖期细胞特异表达的核蛋白，与DNA合 成及肿瘤患者预后有良好的相关性[6]。我们通过ABC免 疫组化染色发现，5μmol/L米非司酮与HO－8910细胞作用4天 ，其核增殖抗原Ki－67表达明显减少，说明细胞增殖 受到抑制。

　　本研究MTT测定及免疫组化实验证明米非司酮对HO－ 8910细胞具有细胞增殖抑制及细胞杀伤作用。Bardon^[7]及 Johnson^[8]曾分别发现米非司酮对人乳腺癌及子宫内膜癌 细胞的上述作用，本研究结果与上述报道的结果一 致。

　　Bardon发现米非司酮对PR阳性的乳腺癌细胞有作用，而 对PR阴性或P预处理的受体阳性细胞无作用，认为米非 司酮的细胞生长抑制及细胞杀伤作用是通过孕激素 受体介导的，但不能完全用激素拮抗作用来解释^[7]。 本实验所用细胞亦为PR阳性，但米非司酮是否通过PR发 挥作用尚有待进一步研究。

　　FCM可检测肿瘤细胞周期分布。大剂量药物引起细胞 坏死，产生较多细胞碎片，影响FCM结果，故我们采用 2.5μmol/L及5μmol/L两个小剂量米非司酮作用于HO－8910细胞 ，通过FCM测定观察细胞增殖周期的变化。结果表明米 非司酮作用24小时可使HO－8910细胞G₂/M期比例减少，影 响了S→G₂期的细胞进程。作用48小时，S期细胞比例也 明显下降，细胞被阻滞于G₀/G₁期。细胞周期中，G₂期为 RNA合成及染色体螺旋化过程，较易受外界影响，而G1期 的启动是细胞周期的关键。本研究结果表明，随药 物浓度的增加及作用时间的延长，米非司酮主要通 过阻滞HO－8910细胞G1→S期的转化，影响DNA合成，而抑 制细胞增殖。

　　临床上已将雌激素拮抗剂他莫西芬应用于卵巢癌的 内分泌治疗，并取得一定疗效。他莫西芬可诱导细 胞表达PR，米非司酮则可增加ER的表达^[9]，故理论上推 测二者联合应用将会产生协同增效作用，如将该方 法应用于临床，可能会给卵巢癌内分泌治疗提供一 种更有效的方法。

(柏敏霜校对)

　　参考文献

　　1，Kiljn JG,Setyono－ Han B,Sander HJ,et al. Pre－ clinical and clinical treatment of breast cancer with antiprogestins. Hum Reprod,1994;9:181

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　　3，Murphy AA,Morales AJ,Kettel LM,et al. Regression of uterine leiomyomata to the antiprogesterone RU486:dose－ response effect. Fertil Steril,1995;64:187

　　4，温汉平,王小宁,孙华蕴,等.肿瘤细胞体外药物实验 MTT分析法.中华肿瘤杂志,1993;15:470

　　5，Kettel LM. Clinical applications of the antiprogestins. Clin Obstet Gynecol,1995;38:921

　　6，Trop SH,Helseth E,Dalen A,et al. Relationships between Ki－ 67 labelling index,amplification of the epidermal growth factor receptor gene,and prognosis in human glioblastomas. Acta Neurochir,1992;117(3～ 4):182

　　7，Bardon S,Vignon F,Montcourrier P,et al. Steroid receptor mediated cytotoxicity of an antiestrogen and an antiprogestin in breast cancer cells. Cancer Res,1987;47:1441

　　8，Johnson C,Bloss J,Dixon P,et al. In vitro growth inhition of endometrial adenocarcinoma with RU486. Gynecol Oncol,1994;52:142

　　9，张俊慧,周剑萍,陆湘云,等.米非司酮对人蜕膜雌、 孕激素受体及血清生殖激素的影响.中华妇产科杂志 ,1996;31(10):610

(1999－12－07收稿)