高表达bcl-2卵巢癌细胞系参与药物抵抗和细胞凋亡作用的研究

中国肿瘤生物治疗杂志 2000年第2期第7卷 论著

作者：田方　李春海　颜春洪　陈高明

单位：田方　李春海　颜春洪　陈高明（军事医学科学院附属医院肿瘤分子生物室　北京　100850）

关键词：bcl-2；卵巢癌；药物抵抗；细胞凋亡

　　摘　要　目的： 探讨化疗的敏感性与细胞凋亡的关系，观察细胞凋亡抑制分子bcl-2在卵巢癌化疗抵抗中的作用。方法： 构建了逆转录病毒bcl-2表达载体pLXSN/bcl-2，应用lipofactin法建立转染bcl-2基因和转染空载体pLXSN的卵巢癌细胞系。MTT法观察细胞系抵抗药物的细胞毒作用。FACS 和DNA琼脂糖凝胶电泳观察bcl-2高表达细胞系在阿霉素诱导细胞凋亡中的变化。结果： 转染bcl-2的卵巢癌细胞系OC3/ bcl-2稳定表达bcl-2分子并抵抗药物介导的细胞毒作用，明显提高细胞的存活率，与此同时也抑制细胞凋亡的发生。结论： 化疗的敏感性与细胞凋亡的调节密切相关，凋亡抑制基因bcl-2在肿瘤耐药中起重要作用。

　　《中国图书资料分类法》分类号　R979.2

The Control of Apoptosis and Drug Resistance in Ovarian Cancer Cells Which Overexpressed bcl-2

Tian Fang　Li Chunhai　Yan Chunhong　Chen Gaoming

　　(Laboratory of Onco-Molecular Biology of Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850)

　　Abstract　Objective: To investigate whether bcl-2 directly contributes to the development of drug resistance and apoptosis in ovarian cancer cell lines cells OC3. Methods: Retrovirus expression vector pLXSN-bcl-2 was constructed and was transfected to ovarian cancer cell line cells OC3 using Lipofectin, with empty vector pLXSN as a control. bcl-2 expression of transfected cells was analyzed by FACS and Western blot and Adr-induced cytotoxicity was measured by MTT assay. Apoptosis was also detected by PI DNA staining and DNA Ladder analysis. Results: pLXSN/bcl-2 transfected cells OC3/bcl-2 overexpressed bcl-2 and were resistant to Adr-induced cytotoxicity. The ability against Adr-induced apoptosis was increased. Conclusion: bcl-2 may play an important role in the resistance to Adr-inducing apoptosis, thereby increasing resistance of OC3/bcl-2 cells to chemotherapy.

　　Key words　bcl-2; ovarian cancer; drug resistance; apoptosis

　　卵巢癌是妇科死亡率最高的恶性肿瘤。化疗在卵巢癌的治疗中占有重要位置，但药物抵抗是化疗失败的主要原因。bcl-2分子与药物抵抗的关系日益受到重视。 随着肿瘤细胞耐药与细胞凋亡的关系的深入研究，在多种白血病化疗耐受的研究中发现，bcl-2表达升高是药物耐受的主要机制^［1］。但bcl-2与实体瘤的耐药关系还有待阐明。本文建立了卵巢癌细胞系OC3 bcl-2高表达细胞系，观察了在阿霉素诱导细胞凋亡中的变化,目的是深入认识高表达的bcl-2在卵巢癌化疗抵抗中的作用，为克服和逆转肿瘤耐药提供理论基础。

　　1　材料与方法

　　1．1　质粒

　　pBluescript SK-bcl-2质粒：约4.0 kD，含有 bcl-2全长 cDNA序列，由颜春洪博士后惠赠。

　　1．2　pLXSN逆转录病毒载体

　　含MOMSV的5′-LTR和MOMlY的3′-LTR，在5′-LTR的下游有EcoRⅠ多克隆酶切位点，以 neo基因表达产生的G418抗性来筛选阳性克隆，由颜春洪博士后惠赠。

　　1．3　酶类

　　EcoRⅠ, Xho Ⅰ, T₄ligase 购自Promega 公司。

　　1．4　细胞系

　　OC3人卵巢癌细胞系,由加拿大温哥华医院健康科学研究中心李吉佑教授惠赠。

　　1．5　主要试剂

　　RPMI1640，G418，Lipofectin购自GIBCO公司。阿霉素购自深圳万乐药业。bcl-2 McAb购自Santu Cruz公司。Saponin 购自Sigma公司。

　　1.6　pLXSN-bcl-2表达载体的构建

图1　pLXSN-bcl-2表达载体的构建

　　Fig.1　Construction of pLXSN-bcl-2 expression vector

　　首先用EcoRⅠ, XhoⅠ酶切质粒pBluescript SK-bcl-2,回收0.8 kD的bcl-2 cDNA, pLXSN质粒用EcoRⅠ, XhoⅠ双酶切使其线性化,再与bcl-2 cDNA进行定向连接反应,转化JM109 感受态细胞,通过氨苄抗性筛选,得到重组质粒pLXSN-bcl-2。

　　1．7　pLXSN-bcl-2表达载体、pLXSN空载体转染OC3细胞

　　采用Lipofectin方法转染质粒DNA，G418筛选转染阳性细胞克隆。实验方法严格按GIBCO公司说明书进行。

　　1．8　间接免疫荧光FACS，Western blot检测转染细胞中bcl-2的表达

　　间接免疫荧光FACS和Western blot 按常规方法进行。细胞裂解后用BCA法测定蛋白浓度（见Sigma产品说明书）调整各细胞蛋白浓度等量上样。

　　1．9　MTT法检测阿霉素对转染细胞存活率的影响

　　以OC3，OC3/pLXSN，OC3/bcl-2作为阿霉素作用的靶细胞，以每孔5×10³/100 μl, 移入96孔板，培养24 h，每孔加入100 μl不同浓度的阿霉素，每一浓度设3个重复孔，37℃，5%CO₂下继续培养48 h，每孔加入20 μl 5 μg/ml MTT,继续培养4 h，弃上清，加入150 μl DMSO，振荡5 min，酶联仪测A₄₉₅值，结果用存活率表示：

　　1．10　PI染色、DNA琼脂糖凝胶电泳检测阿霉素诱导的细胞凋亡

　　用Adr 2.5 μmol/L冲击转染细胞2 h，10%小牛血清1640洗细胞2次，重新培养。于12 h，24 h取细胞做PI染色和DNA琼脂糖凝胶电泳。参考文献［2］进行。

　　2　结　果

　　2．1　pBlu-bcl-2cDNA重组质粒的酶切鉴定

　　纯化质粒DNA，经EcoRⅠ,XhoⅠ酶切鉴定，载体分子量，插入片段分子量均正确。测序结果证实插入片段为bcl-2正确序列。

　　2．2　pLXSN-bcl-2 表达载体的构建

　　为了使外源基因得到有效整合和高表达，我们选择逆转录病毒表达载体。将bcl-2基因定向克隆至pLXSN 载体中，再用 EcoRⅠ,XhoⅠ双酶切，切出0.8 kb的片段(图2)。

图2　pLXSN-bcl-2重组质粒的酶切鉴定

　　Fig.2　Identification of recombinant plasmid

　　pLXSN-bcl-2 by EcoRⅠ and XhoⅠ enzyme digestion

　　M： λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ； 1,2： pLXSN/bcl-2

　　2．3　卵巢癌OC3/bcl-2高表达细胞系的鉴定

　　对扩大培养的细胞系进行间接免疫荧光染色、FACS分析，结果发现，转染pLXSN-bcl-2 的细胞系bcl-2 分子高表达；而转染空载体的细胞则不表达 bcl-2 分子, 将 bcl-2 高表达细胞系传代后再作Western blot,bcl-2分子仍然高表达（见图3）。

图3　Western blot 检测bcl-2的表达

　　Fig.3　The expression of bcl-2 detected by Western blot

　　2.4　阿霉素介导的OC3/bcl-2 细胞的细胞毒实验

　　在相同的药物浓度时,OC3/bcl-2 的存活率明显高于OC3和OC3/pLXSN细胞，表明OC3/bcl-2 细胞对阿霉素产生了抗性（见图4）。

　　2.5　PI染色DNA琼脂糖电泳观察阿霉素诱导的细胞凋亡

　　用2.5 μm阿霉素诱导细胞2 h,继续培养12 h,有约30%OC3细胞发生凋亡,OC3/pLXSN细胞12%发生细胞凋亡,OC3/bcl-2细胞未发生凋亡。24 h后，OC3/bcl-2细胞有40%细胞发生凋亡。图5结果表明,OC3细胞和OC3/pLXSN细胞在药物刺激12 h出现DNA ladder, 而OC3/bcl-2未能观察到DNA ladder。

图4　MTT 法检测阿霉素介导的细胞存活率实验

　　Fig.4　Adr-mediated cell viabilitg by MTT assary

图5　FACS分析阿霉素诱导细胞Sub-G1比例

　　Fig.5　The Sub-G1 ratio of cells incubated with

　　Adr by FACS analysis

　　3　讨　论

　　近年来研究表明，肿瘤细胞凋亡的调控与肿瘤的发生发展密切相关，为认识肿瘤的化疗机理提供了新的思路。过去认为化疗药物杀伤肿瘤细胞的机制主要是坏死（necrosis），而目前研究发现受控于基因指导下的细胞消亡过程与化疗的敏感性密切相关^［3］。卵巢癌是妇科恶性程度最高的肿瘤，化疗耐受是治疗的主要障碍之一^［4］，为了从细胞凋亡角度探讨耐药机制，本文以卵巢癌细胞系OC3为实验对象观察了bcl-2在卵巢癌耐药中的作用。

　　bcl-2是在B细胞淋巴瘤中发现的一种原癌基因，这些B淋巴瘤常常具有特征性的 t(14;18)基因移位。bcl-2基因含有3个外显子和2个内含子，与线虫CED-9基因有23%的同源性，编码一个26 kD的膜蛋白。 在造血组织中, bcl-2分子主要分布于较原始的造血细胞，随着细胞的分化成熟其表达逐渐降低,这与肿瘤形成和化疗抵抗密切相关^［5］。为了观察在卵巢癌中bcl-2与化疗抵抗的相互作用，我们选择了高度恶性又易产生化疗抵抗的卵巢癌细胞系为转染靶细胞。鉴于逆转录病毒载体具有宿主细胞范围广泛，可以完整整合外源基因，对宿主细胞无损伤，始于5′-LTR转录和表达的基因可获得高水平基因产物等优点。构建了逆转录病毒载体介导的bcl-2基因转染系统，这为研究卵巢癌细胞中bcl-2和化疗耐药的关系奠定了基础。

　　细胞凋亡是在基因控制下的自我消亡过程，是一个涉及多基因表达的级联反应。许多与细胞增殖和癌变有关的原癌基因和抑癌基因都参与了细胞凋亡的调控，其中bcl-2被认为是抑制凋亡的主要分子^［6］。本文在药物诱导的细胞毒实验中观察到bcl-2高表达细胞系OC3/bcl-2可以抵抗药物的细胞毒作用，明显提高细胞的存活率；与此同时也抑制细胞凋亡的发生。这表明肿瘤细胞对细胞毒药物耐药的机制之一可能是启动了bcl-2基因，阻断了细胞凋亡的通路，因此表现出在抑制药物诱导的细胞凋亡的同时也降低了细胞对化疗药物的敏感性。可是bcl-2在卵巢癌细胞中是否会自然表达呢？有研究报道在诱导卵巢癌细胞耐药过程中bcl-2的表达逐渐升高。还有实验证明，将敏感细胞与耐药细胞进行mRNA差异筛选，筛选出bcl-2基因，因此称bcl-2为“耐药基因”。bcl-2作为凋亡抑制基因在肿瘤细胞耐药中也起着不可低估的作用。这完全不同于经典的耐药机制，为研究细胞耐药提供了一个新思路。也就是说在临床化疗中，bcl-2是否可作为逆转耐药靶分子或耐药检测分子是一个值得重视的问题。

　　中国博士后基金(98623),自然科学基金(39870784)共同资助

　　田方,女,43岁,博士后,副研究员,主要从事分子免疫肿瘤免疫研究

　　参 考 文 献

　　1，Simonian PL, Grillot DA, Nunz G， et al. bcl-2 and bcl-XL can differentially block chemotherapy-induced cell death. Blood, 1997， 90(3): 1208

　　2，Smith CA, Williams GT, Kirgston R， et al. Antibodies to CD3/T-cell receptor complex induce death by apoptosis in immature T cells thymic cultures. Nature, 1989， 337: 181

　　3，Pepper C, Hoy T, Bentley P， et al. Elevated bcl-2/Bax are a consistent feature of apoptosis resistance in B-cell chronic lymphocytic leukaemia and are correlated with in vivo chemoresistance. Leuk Lymphoma, 1998， 28: 355

　　4，Eliopoulos AG, Kerr DJ, Herod J， et al. The control apoptosis and drug resistance in ovarian cancer: Influence of p53 and bcl-2. Oncogene, 1995， 11: 1217

　　5，Ellis PA, Smith IE, Detre S， et al. Reduced apoptosis and proliferation and increased bcl-2 in residual breast cancer following preoperative chemotherepy. Breast Cancer Res Treat, 1998， 48(2): 107

　　6，Reed JC, Miyashita T, Takayama S， et al. bcl-2 family proteins: Regulators of cell death involved in the pathogenesis of cancer and resistance to therapy. J Cell Biochem, 1996， 60: 23

　　7，Zunino F, Perego P, Pilotti S， et al. Role of apoptosis response in cellular resistance to cytotoxic agents. Pharmacol Ther, 1997， 76: 177

(1999-05-19收稿； 1999-09-22修回)