原发性上皮性卵巢癌组织中c-erbB2基因扩增及其临床意义

中华肿瘤杂志 1998年第5期第0卷 临床研究

作者：杨慧娟　张国玲　许凯黎　孙敏　周瑾　秦瑞娣

单位：200032 上海医科大学附属肿瘤医院(杨慧娟、张国玲、孙敏、秦瑞娣)；上海市肿瘤研究所(许凯黎、周瑾)

　　关键词： 卵巢肿瘤　　基因，erbB2　　基因扩增

　【摘要】　目的　检测原发性上皮性卵巢癌组织中c-erbB2基因扩增，以探讨其在卵巢癌临床诊治中的价值。方法　采用Southern 印迹技术，结合特异性c-erbB2 探针,对108例原发性上皮性卵巢癌及34例良性、7例交界性卵巢肿瘤手术切除组织做DNA扩增。结果　原发性上皮性卵巢癌c-erbB2基因扩增频率为32.4%(35/108)，而良性、交界性卵巢肿瘤均未出现扩增(P＜0.001)，且c-erbB2基因的扩增和上皮性卵巢癌的FIGO分期(P=0.025)、肿瘤细胞分化程度(P=0.011)及初次手术后残存肿瘤的大小(P＜0.001)呈正相关。经对84例II～IV期原发性上皮性卵巢癌进行预后分析，结果表明，c-erbB2基因扩增为影响预后的独立因素,c-erbB2基因扩增阴性者3年生存率为57.7％，而阳性者为28.4％，两者差异具有显著性(P=0.016)。结论　c-erbB2基因扩增可能和原发性上皮性卵巢癌的发生有关，c-erbB2基因扩增阳性患者恶性程度高，手术成功率低，预后明显差于阴性患者。检测癌组织中c-erbB2基因的扩增，将有助于对卵巢癌患者的病情监测和预后判断。

　　c-erbB2 gene amplification in human primary epithelial ovarian cancer and its clinical significanceYang Huijuan, Zhang Guoling， Xu Kaili, et al.Shanghai Cancer Hospital, Shanghai Medical University. Shanghai 200032

　　【Abstract】　Objective　To study c-erbB2 gene amplification in human primary epithelial ovarian cancer and its clinical significance. Methods　One hundred forty nine samples of primary epithelial ovarian tumors, including 34 beign tumors,7 borderline tumors and 108 carcinoma, were studied for c-erbB2 gene amplification by Southern blot analysis. Results　 c-erbB2 gene amplification was detected in 35 (32.4%) of the 108 cases with primaey epithelial ovarian carcinoma, while all cases with beign tumors and borderline lesions were negative (P＜0.001).　There was a strong correlation between c-erbB2 gene amplification and FIGO stage of human ovarian carcinoma (P=0.026), degree of cell differentiation (P=0.011) and the size of residual tumor (P＜0.001). Univariate and multivariate analysis showed that c-erbB2 gene amplification was an independent prognostic factor. The average 3-year survival rate was 28.4% in patients with gene amplification and 57.7% in patients without gene amplification(P=0.016). Conclusion　c-erbB2 gene amplification occurs almost in 1/3 of the patients with ovarian carcinoma examined. Ovarian carcinoma with c-erbB2 gene amplification is highly malignant and associated with poor prognosis.

　　【Subject words】　Ovarian neoplasms　　Genes, c-erbB2　　Gene amplification

　　c-erbB2基因又称neu、HER-2基因，现已知其结构及＞50％的氨基酸序列与EGFR相似，具有酪氨酸蛋白激酶活性，起调节上皮细胞生长和分化的信号转换通道作用。在其配体 gp30作用下，细胞内TPK活性增加，通过生长因子→受体→GTP信号及胞内代谢→DNA表达这一作用系统,无限制循环，造成细胞生长分化失控，从而导致癌瘤发生^［1～3］。近年来国外大量研究表明，约有30％以上的卵巢癌出现c-erbB2基因扩增和高表达，此点可作为卵巢癌复发、转移、预后及生存期的一种监测指标^［4］。但国内有关这方面的报道较少。为此，我们对108例原发性上皮性卵巢癌及34例良性、7例交界性卵巢肿瘤手术切除组织进行DNA扩增，以探讨原发性上皮性卵巢癌组织中c-erbB2基因的扩增，及其在卵巢癌临床诊治中的价值。

材料和方法

　　1.病例选择：收集上海医科大学附属肿瘤医院1989年12月～1994年2月间，原发性上皮性卵巢癌手术切除标本共108例。患者平均年龄49.9岁(31～80岁)，全部病例均经病理证实。标本取自于肿瘤组织无坏死区域的实质部分。手术方式以全子宫+双附件+大网膜切除术为主。全部病例均于术后行以顺铂为主的多途径联合化疗3～8疗程，其中尚有65例于术前行以顺铂为主的腹腔和(或)静脉化疗2～4疗程。另有34例良性、7例交界性卵巢肿瘤作对照。

　　2.实验步骤：

　　(1)大分子DNA的抽提、纯化：参照Manaitis法进行。

　　(2)Southern印迹及分子杂交^［5］：①DNA的酶切及电泳：经采用Ecor I限制性内切酶(Beoringer公司)对肿瘤组织DNA进行酶切，0.8%琼脂糖(Promega公司)凝胶电泳法(60V,1～2小时)将酶切后的DNA电泳，结束后凝胶板经碱变性液及中和液处理后，吸印于尼龙膜片上(约2～3天)。②同位素标记探针：经采用α-³²p-dCTP(Amersham公司)对特异性c-erbB2探针(日本国立癌症研究所基因库馈赠)作随机引物法标记。③尼龙膜片预杂交：将适量鱼精DNA于100℃变性10分钟后，加入封闭的尼龙膜片中，置于52℃水浴摇床内反应12小时。④尼龙膜片杂交：标记同位素的探针(比放射性为1×10⁹ cpm/μg DNA)加入预杂交的尼龙膜片中置于52℃水浴摇床内反应48小时后洗涤膜片，空气干燥，用X线摄片覆盖、曝光、冲晒，摄片上杂交带用分光光密度计扫描，观察结果。

　　3.c-erbB2基因扩增的判断标准^［5］：以扩增倍数＞2.5倍为阳性标准。

　　4.患者随访：149例患者于首次手术之日起随访，截止日期为1997年2月28日。

　　5.统计学方法：全部统计工作均在上海医科大学卫生统计教研组IBM微机上进行。108例I～IV期上皮性卵巢癌c-erbB2基因扩增与临床病理因素间的相关性研究，采用EpiInfo 6.0软件进行，χ²检验；89例II～IV期上皮性卵巢癌的生存率采用stata 5.0软件 Kaplan-meier法计算，并采用Long-rank法进行预后单因素分析。以SAS 6.11软件 Cox比例风险模型，对上皮性卵巢癌预后进行多因素分析。

结果

　　1.149例上皮性卵巢肿瘤c-erbB2基因的扩增：108例上皮性卵巢癌中有35例发生c-erbB2基因扩增，频率为32.4％，而34例良性、7例交界性卵巢肿瘤无一例扩增倍数＞2.5倍。经检验，差异有显著性(P＜0.001，表1)。

　　2.c-erbB2基因扩增和上皮性卵巢癌临床病理因素间的相关性研究：由表1可见，c-erbB2基因扩增除和年龄、组织学分类、术前化疗无相关性外，同FIGO分期、肿瘤细胞分化程度、初次手术后残存肿瘤的大小均有相关性。即病期越晚，肿瘤细胞分化程度越差，c-erbB2基因扩增频率越高。31例c-erbB2基因扩增阳性患者，按初次手术后残存肿瘤大小为0、＜2 cm和≥2 cm分为3组，其各组所占比例分别为16.1％、29.1％和54.8％，而阴性者分别为49.2％、34.4％和16.4％，二者差异有显著性(P＜0.001)。

　　3.c-erbB2基因扩增与上皮性卵巢癌预后的相关性研究：c-erbB2基因扩增阴性的34例良性、7例交界性上皮性卵巢肿瘤，于随访期间无一例失访，平均随访时间为47.2个月，无一例死于癌变。由于I期卵巢癌患者5年存活率高达90％，本组19例中除1例失访外，17例均于随访期间存活，3年存活率为94.4％，故我们仅对89例II～IV期上皮性卵巢癌结合随访资料进行预后分析。89例中，除3例死于其他疾病，另有2例于术后出院时即失访而未列入生存率统计及预后分析外，余84(94.4％)例患者平均随访时间为38.1(5～84)个月，其中33例存活(包括24例无瘤存活、9例带瘤存活)，51例死亡(均死于卵巢癌)。总3年存活率为39.3％。单因素及多因素分析结果表明，组织学分类、术前化疗均与预后无相关性；而年龄、FIGO分期、肿瘤细胞分化程度、首次细胞减灭术后残存肿瘤大小及c-erbB2基因扩增，均为影响预后的独立因素。其中c-erbB2基因扩增阴性者3年生存率为57.7％，而阳性者为28.4％(表2)。

讨论

　　c-erbB2基因为1989年由Salmon等^［1］报道的与乳腺癌和卵巢癌发生相关的癌基因，而且其mRNA或蛋白可作为乳腺癌复发转移、预后及生存期的一种监测指标。目前研究表明，约有30％以上的卵巢癌出现c-erbB2基因扩增和高表达，且和卵巢癌的预后亦相关^［4］。Salmon等^［1］在87例卵巢癌的长期随访中发现，c-erbB2基因扩增倍数为1倍、2～5倍和＞5倍者的存活期中位数分别为1 879，959和243天(P＜0.0001)，免疫组化染色(-)～(+)、(++)和(+++)者分别为1 960，1 093和417天(P＜

表1　c-erbB2基因扩增和上皮性卵巢癌临床病理的相关性研究

表2　单因素和多因素分析c-erbB2基因扩增在

　　上皮性卵巢癌中的预后价值

　　注：P＜0.25时差异有显著性

　　0.0126)，因此认为，c-erbB2基因扩增和高表达可作为卵巢癌预后的判断指标。国内张国玲等^［6］、许凯黎等^［7］分别从DNA、RNA水平探讨c-erbB2基因的扩增和卵巢癌恶性程度的相关性，发现均呈正相关。但Rubin等^［8］采用免疫组化法分析105例晚期卵巢癌患者(Ⅲ、Ⅳ期)的c-erbB2基因表达时，发现有24％发生了高表达，但并未发现其同临床病理指标及预后存在相关性。这可能和检测方法、病例选择、随访时间的不同有关。最近，Fajac等^［9］报道，经对长期随访的(平均随访时间为71个月)65例卵巢癌患者(包括I期 7例、II期7例、III期38例、IV期11例)c-erbB2基因扩增和高表达状况的分析结果发现，c-erbB2基因扩增与预后有相关性，但过度表达与预后无相关性。上述资料提示，检测核酸中c-erbB2基因扩增，较基因产物高表达对上皮性卵巢癌的预后判断更有价值。但国内有关c-erbB2基因扩增在卵巢癌预后判断中的价值尚未见报道。为此我们采用Southern印迹技术作基因扩增研究，结果发现，108例上皮性卵巢癌患者中，有35例发生c-erbB2基因扩增，总扩增频率为32.4％，而34例良性、7例交界性卵巢肿瘤无一例扩增，这与文献报道一致(P＜0.001)^{［1，3～9］}，提示c-erbB2基因扩增和卵巢癌的发生相关。经对c-erbB2基因扩增同临床病理因素的相关性研究，发现其同FIGO分期、肿瘤细胞分化程度、初次手术后残存肿瘤的大小均呈正相关，即病期越晚，肿瘤细胞分化程度越低，其扩增频率亦越高；c-erbB2基因扩增阳性者,初次手术后残存肿瘤＜2 cm者的比例明显低于阴性者。以上结果充分表明，c-erbB2基因扩增阳性者，疾病恶性程度明显高于阴性者，而手术成功率明显低于阴性者。另一方面，经多因素分析，发现c-erbB2基因扩增与卵巢癌患者的预后呈负相关，即c-erbB2基因扩增阳性者预后明显差于阴性者。以上资料提示，c-erbB2基因扩增不仅可作为卵巢癌患者疾病恶性程度及预后的判断指标，而且因c-erbB2基因扩增阳性的患者疾病恶性程度高，手术成功率低，预后差，从而提示临床对这部分患者应采取其他的综合治疗措施，以提高疗效、改善预后。

参考文献

　　1Slamon DJ, Godolphin W, Ajones L, et al. Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer. Science, 1989,244:707-712.

　　2Bargmann C, Hung MC, Weinberg RA. The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor related protein. Nature,1986,319:226-230.

　　3Berchuck A, Kamel A, Whitaker R, et al. Overexpression of HER-2/neu is associated with poor survival in advanced epithelial ovarian cancer. Cancer Res, 1990,50: 4087-4091.

　　4Gallion HH, Pieretti M, De Priest PD, et al. The molecular basis of ovarian cancer. Cancer, 1995,76(10 suppl):1992-1995.

　　5许凯黎, 张国玲, 沈兆忠，等. 人体乳腺癌及卵巢癌组织中c-erbB2基因的扩增. 上海医学, 1992, 15:461-463.

　　6张国玲,许凯黎, 俞韶音，等. 人体卵巢癌组织中c-erbB2基因的扩增. 中华妇产科杂志,1994, 29:401-403.

　　7许凯黎, 张国玲, 周瑾, 等. c-erbB2癌基因在卵巢癌中mRNA水平的表达. 中华医学杂志, 1995,75:233-234.

　　8Rubin SC, Finstad CL, Wong GY, et al. Prognostic significance of Her-2/neu expression in advanced epithelial ovarian cancer: a multivariate analysis. Am J Obsetet Gynecol, 1993,168(1 part1):162-169.

　　9Fajac A, Benard J, lhomme C, et al. c-erbB2 gene amplification and protein expression in ovarian epithelial tumors: evaluation of their respective prognostic significance by multivariate analysis. Int J cancer,1995, 64:146-151.

　　本课题受上海市科委基金及卫生部科学基金资助

(收稿：1998-01-06　　修回：1998-03-12)