流感亚单位疫苗和基因工程疫苗及核酸疫苗研究

广西预防医学 2000年第3期第6卷 综述

作者：胡文蓉　杨进业

单位：胡文蓉(浙江省医学科学院普康生物技术公司　杭州 310009)；杨进业(广西壮族自治区卫生防疫站　南宁 530021)

　　中图分类号：R511.701　文献标识码：A　文章编号：1007－158X(2000)03－0177－04

　　近年来，随着分子生物学科的发展，利用基因工程技术和免疫学技术合成流感重组亚单位疫苗及核酸疫苗以提高流感疫苗的免疫效果引起了人们的高度重视，并将成为流感疫苗研制和开发利用的新方向。

　　1　流感病毒的生物学结构和免疫特点

　　流感病毒颗粒由三层组成，最外层是两种突起的表面抗原，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，中间层由一层类脂体和一层膜蛋白(MP)构成，核心层是RNA基因及与之结合的蛋白质，即核蛋白(NP)。MP和NP是决定流感病毒型别的型特异性抗原，抗原性较稳定，其抗体无保护作用。HA和NA是甲型流感病毒亚型划分的主要依据，HA抗体能中和病毒和抑制血凝素，是最主要的保护性抗体，NA抗体能限制病毒的释放和扩散，也有保护作用^[1]。

　　由于流感病毒基因组由7个(C型)或8个(A、B型)分节段的单股负链RNA构成，易于发生变异，也是不同毒株之间能发生很高基因重组率的原因。如引起大流行的1957年和1968年人类流感株，经分子流行病学方法证实是由人禽流感病毒通过基因重组而来^[1]。

　　甲型流感病毒根据HA和NA抗原又可分为不同亚型，HA有13个亚型，NA有9个亚型，目前已发现在人间流行的有H1N1H2N2、H3N2、H5N1[2]4个亚型。由于抗原漂移和抗原转变，甲型流感病毒易发生量变和质变的抗原变异。

　　2　现行流感疫苗概述

　　目前我国市售的流感疫苗为灭活疫苗，含有两个A型和一个B型病毒株的表面蛋白。为克服流感疫苗的抗原变异现象，WHO每年均要根据流行毒株的监测，提出年度流行季节使用流感疫苗成分的建议，如建议1998～1999年疫苗成分为^[3]：类A/悉尼/5/97(H3N2)抗原、类A/北京/262/95(H1N1)抗原、类B/北京/184/93抗原；1997～1998年为：类A/武汉/359/95(H3N2)抗原、类A/巴伐利亚/7/95(H1N1)抗原、类B/北京/184/93抗原^[4]。

　　流感疫苗的有效性取决于疫苗受者的免疫功能状态及疫苗中的病毒株与流行病毒株的相似程度。健康成人接种后2周内产生抗体，4～6周达到高峰。在自然感染或免疫接种后对特定流感病毒株的免疫力可持续3～6年以上。有学者证实^[5]，用流感灭活疫苗对健康人群重复接种5年可使流感发病率和感染率降低，并减少并发症。但一般建议对成人的接种方案是单剂肌注，仅对未接种过疫苗的9岁以下儿童建议接种第2剂疫苗。

　　虽然现行流感疫苗对防治同株流感病毒感染较为有效，但不能有效地控制流行，保护人群。其原因主要有以下几点：(1)接种率低。据估计，40％以上的高危人群(如老年人、慢性肺病、心脏病、肾病或免疫抑制者)未接种疫苗。(2)病毒表面蛋白常发生抗原漂移和转变，突变为新的病毒株，市售疫苗要跟上这种变化，每年必须加入新的流行株。新流行株的预测工作必须在流行季节到来之前完成，但有时预测株仍与实际流行株不同。(3)肌肉注射疫苗不能在流感病毒首先感染的上呼吸道的上皮细胞粘膜表面激发分泌性抗体或感染恢复所需要的细胞介导免疫应答^[6]。

　　3　流感抗原表位亚单位疫苗的研究

　　抗原决定簇是由数量不等的抗原表位组成的。用抗原表位氨基酸序列制备的疫苗称为抗原表位亚单位疫苗，包括合成肽疫苗和抗原表位亚单位疫苗。合成肽疫苗由于仅代表了蛋白抗原的一部分，很难象蛋白抗原疫苗一样诱导出多种免疫反应。又由于其通常不具备抗原蛋白上抗原表位所具有的构象和免疫原性弱，很难引起较强的免疫应答以获得长期的免疫力。重组抗原表位亚单位疫苗是将具有免疫保护作用的人工合成抗原肽结合到载体上，再加上佐剂制成的制剂^[7]。应用到流感疫苗制作上，是将HA和NA抗原决定簇片段插入载体制成新疫苗，提高其免疫效果。Ennis等研究发现，利用小鼠试验，将灭活流感病毒抗原插入载体ISCOM(免疫促进复合体)后，使50％～60％的受者提高了特异性细胞毒性T淋巴细胞免疫记忆，而常规苗仅能提高5％左右^[8]。提高亚单位苗免疫效果的一个重要因素是找到合适的佐剂，Minutello等人研究发现^[9]，在老年人中接种有佐剂的流感亚单位苗时，虽然局部反应率高于无佐剂疫苗组，且多次接种后反应原性并无增强趋势，但使用佐剂组可提供比无佐剂组更广泛的免疫应答。Tamizifar等通过小鼠实验证明^[10]，全细胞百日咳、白喉和破伤风(wDTP)菌苗对流感亚单位疫苗的免疫应答有较强的佐剂作用，认为佐剂作用存在于百日咳杆菌的脂多糖(LPS)中。亚单位疫苗由于其反应原性较小，而免疫原性较强，近几年得到了广泛使用。

　　4　流感基因工程疫苗研究

　　JohnJT等用表达流感病毒A/北京/32/92(H₃N2)HA基因插入昆虫细胞产生重组抗原rHAO^[11]，将其免疫效果与三价亚病毒疫苗和安慰剂对照结果比较表明：rHAO疫苗在青年和老年人中既能诱导功能性抗体，又能诱导结合性抗体，并且随着rHAO剂量的增加，应答率及抗体水平也随之上升。成人组的抗体应答水平高于老人组，在成人组和老人组中接种rHAO的平均抗体滴度明显高于接种亚病毒疫苗者，表明接种大剂量rHAO疫苗安全有效。LeviR等人将激发B细胞，辅助性T细胞和细胞毒性T淋巴细胞应答的3个表位的寡核苷酸分别插入沙门菌鞭毛蛋白基因，得到杂交鞭毛蛋白，研究其3种蛋白共同使用及使用1～2种蛋白后免疫效果的差别，结果表明使用3种蛋白组的保护力和免疫效果明显好于使用1～2种蛋白组，表明需刺激免疫系统的各个环节才能产生有效的抗流感免疫应答，并且这种合成重组的流感成分适宜于制备广谱抗流感疫苗^[12]。基因工程疫苗制作时需要流感病毒复制用的细胞培养系统，Palache等人研究了用哺乳动物细胞(MDCK)或鸡胚生产的流感亚单位疫苗的免疫原性和反应原性，发现MDCK细胞系及其生产的疫苗较为安全，接种者未发生严重反应。该疫苗与鸡胚疫苗一样，临床耐受性良好^[13]。

　　5　流感核酸疫苗的研究

　　1993年Robinson等直接将编码流感病毒HA的DNA肌注小鸡和小鼠，结果这些动物产生了抗特异性抗体并能抵抗致死剂量的流感病毒攻击。1993年Merck研究室的Ulmer等将编码NP的cDNA插入质粒中，并置于Rous肉瘤病毒(RSV)或巨细胞病毒(CMV)启动子的控制之下，将质粒直接注射小鼠四头肌后，诱导出抗NP特异性抗体和细胞毒性T淋巴细胞^[14]。RandallDeck等研究了流感HADNA疫苗免疫效果^[15]，发现可有效诱导体液免疫应答，即使一次注射小剂量也可诱生良好的保护作用，降低小鼠发病率和死亡率。Bot等人通过对新生小鼠注射NPDNA疫苗，发现能诱导有效的细胞免疫应答^[16]，认为DNA疫苗可用来预防水平或垂直传播的可危及生命的流感病毒对婴儿和儿童的感染。Sha、Vincent等人还研究了流感HADNA疫苗经粘膜免疫对小鼠的免疫效果^[17]，发现能在血浆中诱导出抗体应答，同时也可在粘膜表面诱出IgA应答。KodihalliS等研究了血凝素H5亚型DNA疫苗对小鼠的免疫效果^[17]，发现不能预防鸟流感病毒H5NI型的感染，但对预防死亡是有效的。上述研究，预示着流感DNA疫苗将会开创流感疫苗预防的新天地。

　　但DNA疫苗本身仍存在着安全性问题。一是转入体内的外源DNA有可能整合到宿主细胞染色体基因组DNA上，使宿主细胞肿瘤抑制基因失活或肿瘤基因活化，使宿主细胞转化为癌细胞。二是DNA免疫接种后可能引起免疫系统本身的功能紊乱。三是少量抗原长期表达，尤其对儿童，很可能引起针对该抗原的免疫耐受，在遭遇病原体后反而会引起严重感染。由于核酸疫苗在体内的转归尚未完全研究清楚，因此，在核酸疫苗投入使用前，必须有证据证明已产生出正确的序列并能在生产中保持稳定，且需要有确保生产条件及成品质量恒定的方法，最后，还需考虑到疫苗接种剂量的恒定。

　　胡文蓉(1967－)，女，浙江省台州市人，医师，主要从事医学生物学研究工作。

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2000－03－10收稿