嗜水气单胞菌hec毒素溶血试验诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿症

中华血液学杂志 2000年第10期第21卷 论著

作者：刘海丽　许彩民　吕照江　陆承平　潘华珍　张之南

单位：刘海丽　许彩民潘华珍（100005　北京， 中国医学科学院基础医学研究所、中国协和医科大学基础医学院、医学分子生物学国家重点实验室）；吕照江　张之南（北京协和医院）；陆承平（南京农业大学）

关键词：血红蛋白尿，阵发性；hec毒素；抗原，CD_{59<；sub>；糖肌醇磷脂结合蛋白；嗜水气单胞菌}

　　【摘要】　目的　研究嗜水气单胞菌hec毒素对红细胞的作用，为阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）的临床诊断提供一种新方法。方法　从患暴发性传染病的家养鲫鱼分离到嗜水气单胞菌，其培养上清经硫酸铵沉淀获得粗提毒素，经DEAE纤维素层析得提纯毒素。粗提毒素作用于PNH和其他贫血患者及正常人的红细胞，采用96孔板在波长630nm酶标仪比色；同时用CD₅₉单抗和FITC标记的羊抗鼠IgG标记红细胞，以流式细胞仪分析毒素作用前后CD₅₉标记率。结果　对15例PNH患者、15名正常人、15例非PNH贫血患者的红细胞，进行hec毒素试验，发现毒素在0.125g/L、37℃作用20min后，正常人和非PNH贫血患者的红细胞完全溶解，而PNH患者存留红细胞的百分率与CD₅₉标记率成反比。毒素作用前后流式细胞仪检测结果表明，毒素可以特异地作用于CD₅₉阳性细胞。结论　PNH患者的红细胞比其他非PNH贫血患者及正常人的红细胞有明显的抗毒素溶破作用，且毒素作用后存留细胞的百分数反映CD₅₉标记率，故可作为PNH诊断的敏感、特异、简便可行的新诊断方法。

Diagnosis of PNH by detecting the resistance of RBCs to the hemolytic effect of hec toxin secreted by Aeromonus hydrophila

LIU Haili　XU Caimin　LU Zhaojiang

　　（Department of Biochemistry and Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences and PUMC hospital, CAMS & PUMC, Beijing　100005,China）

　　【Abstract】　Objective　To study the feasibility of diagnosing paroxysmal nocturnal hemoglobinuria（PNH） with hec toxin (secreted by Aeromonus hydrophila) test. Methods　 The crude hec toxin was extracted from the culture medium of Aeromonus hydrophila by precipitating with saturated （NH₄）₂SO₄ and then purified through DEAE52. This crude hec toxin was used to act on red blood cells（RBCs） from patients with PNH, non-PNH anemias, and normal persons. Absorbance at 630nm was measured to quantitate the extent of hemolysis. Hec treated and untreated RBCs were both stained with anti CD₅₉ monoclonal antibody and FITC labelled goat-anti-mouse IgG. The percentage of CD₅₉⁺ cells was detected by flow cytometry. Results　After hec toxin treatment, RBCs from PNH patients showed resistance to the toxin hemolysis, which was negatively related to the CD₅₉^＋ cells percentage, while RBCs from non-PNH were lysed totally. Conclusion　RBCs from PNH have obvious resistance to the hemolytic effect of hec toxin, and the percentage of remained unhemolytic cells reflect the severity of PNH. Resistance detection of RBCs to hec toxin can be used for the diagnosis of PNH.

　　【Key words 】　Hemoglobinuria，paroxysmal；　hec toxin； 　Antigen，CD₅₉；　Glycosylphosphatidylinositol protein；　Aeromonus hydrophila

　　阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）是一种后天获得性克隆性疾病，由于PIG-A基因突变，导致血细胞表面缺失一类糖肌醇磷脂结合蛋白（GPI蛋白），包括一些补体调节蛋白如CD₅₉、CD₅₅等，使血细胞对补体敏感。1937年迄今一直沿用Ham建立的酸化血清溶血试验诊断本病^［1］，但有20%～30%的患者呈阴性反应。1979年我们将蛇毒因子溶血试验用于PNH的诊断，特异性比较强^［2］。但这两种方法均以补体溶血为基础，检测易被补体破坏的红细胞，检测结果常受病情及多种实验条件的影响。近年来，利用流式细胞仪（FACS）检测和计数缺乏CD₅₉抗原的细胞，被认为是诊断PNH最敏感、最合理的方法^［3］，但仪器和CD₅₉抗体的价格均很昂贵，难以推广、普及。根据最近文献报道，嗜水气单胞菌毒素能特异地与细胞膜上的GPI蛋白结合，在膜上形成孔洞而使细胞溶破^［4］。由于缺失GPI蛋白是PNH细胞的专有特性，提示我们可以用此法把PNH细胞和正常细胞区分开，从而为PNH诊断提供一种简便的方法。我们利用自己提取的嗜水气单胞菌hec毒素^［5］作用于正常人和PNH患者及其它类型贫血患者的红细胞，发现PNH红细胞不易遭受毒素的破坏，在一定的毒素浓度和作用时间下细胞存留率与流式细胞仪测得的CD₅₉阴性细胞率一致，而正常人及其它贫血患者的红细胞则几乎都被溶破。因此，检测红细胞有无抵抗毒素作用作为PNH特异、敏感、简便可行的实验诊断方法，便于推广，有很大实用价值。

　　材料和方法

　　1　hec毒素的提纯和鉴定

　　1.1　细菌培养及hec毒素提纯：嗜水气单胞菌J-1株由南京农业大学陆承平教授提供。细菌培养及hec毒素提纯方法见文献［5］，条件稍有不同：嗜水气单胞菌J-1株，接种于普通LB培养基，于37℃置180r/min摇床振荡36h。培养上清经硫酸铵分级沉淀获得粗提hec毒素，经DEAE纤维素DE52柱层析，紫外监测和收集系统（Bio-Rad公司产品）按吸收峰收集，获得提纯hec毒素。

　　1.2　活性的鉴定：以正常人红细胞被溶破为指标。按吸收峰收集的各部分毒素，浓度均调至0.125g/L，37℃作用于正常人红细胞20min后，用酶标仪在630nm处测吸光度（A），以加毒素和未加毒素的两孔A值相比，该比值小于10%，说明红细胞大部分被溶破，即认为有毒素活性。

　　1.3　胰酶的消化：将1.0g/L粗提毒素及1.0g/L提纯毒素用胰酶（AMRESCO公司产品）消化，作用条件如下：胰酶浓度为0.01g/L、0.10g/L，25℃保温15min；相同胰酶浓度，37℃保温15min。

　　1.4　不连续SDS-PAGE： 按Laemmli方法^［6］，浓缩胶25g/L，分离胶100g/L，室温电泳2h，考马氏亮蓝R250染色。

　　2　检测对象及毒素对红细胞的作用

　　红细胞采自北京协和医院及北京同仁医院住院及门诊患者。按张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》（第2版）选择PNH患者15例，再生障碍性贫血4例、自身免疫性溶血性贫血4例、营养性巨幼细胞性贫血2例、缺铁性贫血1例、其他未明原因贫血4例，正常对照为本院献血员15名。

　　取自然沉降的外周血红细胞，PBS（pH 7.4）洗涤1次，用PBS稀释成0.8%的红细胞悬液。96孔酶标板各孔加50μl PBS，粗提毒素（2.0g/L）与提纯毒素（1.0g/L）各50μl分别在96孔酶标板上倍比稀释，以不加毒素的孔作为标准对照。每孔用多道加样器同时加与毒素等体积的0.8%红细胞50μl，37℃保温，每隔5min用酶标仪在波长630nm处测A值。将各孔与标准对照孔的A值相比，因为红细胞溶破时630nm处A值下降，所以我们用毒素作用与未作用的两孔A值之比代表毒素作用之后存留的红细胞与总红细胞的比值。

　　3　毒素作用前、后红细胞的CD₅₉标记率测定

　　粗提毒素（2.0g/L）2.5μl 用PBS稀释至40μl，然后与40μl 0.8%红细胞悬液混合，37℃作用10min ，PBS洗涤3次，细胞重悬于100μl PBS中，加入2μl CD₅₉单抗（PharMingen 公司产品，美国），37℃标记30min。同时取未加毒素的0.8%红细胞10μl 加PBS至100μl，加2μl CD₅₉单抗，37℃标记30min ，PBS洗涤。加二抗羊抗鼠IgG-FITC（Jackson ImmunoReseach Laboratories公司产品），37℃避光标记30min ，用PBS洗涤2次后重悬至100μl。处理后的细胞用 Coulter Epics Elite 流式细胞仪测定细胞的CD₅₉标记率。

　　结果

　　1　毒素的纯度鉴定　将粗提毒素、提纯毒素、消化后的粗提毒素、外购纯毒素进行不连续SDS-PAGE，电泳图谱如图1，在相对分子质量为60.0×10³处有一主带。经DEAE纤维素DE52分离纯化后，有毒素活性的部分即为主带，相对分子质量略高于相对分子质量为52.5×10³的外购Aerolysin毒素。粗提毒素和提纯毒素用胰酶消化后，毒素的相对分子质量和毒素活性均无变化（未显示）。

1：蛋白相对分子质量标准；2：外购Aerolysin毒素；

　　3：提纯hec毒素；4：粗提hec毒素

图1　hec毒素SDS-PAGE图谱

　　2　毒素对红细胞的作用　毒素适当稀释后与红细胞作用，正常人和非PNH贫血患者的红细胞迅速破溶，表现为波长630nm处的A值急剧降低至零；而PNH患者的红细胞则只有部分破溶，表现为波长630nm处的A值缓慢下降到某一值而不再下降（图2）。

图2　毒素对红细胞的作用

　　2.1　红细胞悬液：参考测定溶血度所用的浓度0.8%。

　　2.2　不同浓度的毒素对红细胞的作用：同一时间点，随着毒素浓度增大，存留细胞数逐渐减少，表现为PNH组减少缓慢，非PNH贫血组及正常组减少迅速。毒素作用的最适浓度为0.125g/L。浓度太低，需要的作用时间太长；浓度太高，作用时间太短，容易因操作时间产生误差。

　　2.3　保温时间对毒素与红细胞作用的影响：同一毒素浓度下，随时间延长，存留红细胞数越来越少，但PNH组减少缓慢，正常组及非PNH组减少迅速(图3)。粗提毒素浓度0.125g/L,37℃ 20min后非PNH及正常红细胞已基本无存留，而PNH组则有一定比例红细胞存留。因此以37℃ 20min为毒素作用的最适温度和时间。

图3　0.125g/L毒素对红细胞的作用

　　2.4　粗提毒素与提纯毒素对红细胞作用的比较： 粗提毒素0.125g/L与提纯毒素0.03g/L作用于正常和PNH红细胞，37℃ 20min后粗提毒素可达到与提纯毒素相同的作用，二者作用曲线一致，因此可以直接用粗提毒素0.125g/L，37℃20min作用于红细胞，根据细胞溶破情况来诊断是否是PNH。

　　3　流式细胞仪测定结果　红细胞的CD₅₉标记率表明：PNH患者的红细胞在毒素作用后，存留细胞的CD₅₉阴性率比毒素作用前显著提高(图4)；正常组红细胞加毒素作用前CD₅₉的标记率＞99.5%，毒素作用后几乎无细胞存留。波长630nm处A值的结果与显微镜计数结果大致相符，即相同条件下毒素作用后正常人和非PNH贫血患者基本无细胞存留，而PNH仍有20%～80%的细胞存留，存留率与流式细胞仪所测CD₅₉标记率呈负相关(见表1)。

a:PNH例1的红细胞在毒素作用前CD₅₉^＋细胞占69.1%；

　　b:PNH例1红细胞在毒素作用后CD₅₉^＋细胞存留48.9%；

　　c:PNH例2红细胞在毒素作用前CD₅₉^＋细胞占45.3%；

　　d:PNH例2红细胞在毒素作用后CD₅₉^＋细胞存留12.6%；

　　e：正常红细胞在毒素作用前CD₅₉^＋细胞占99.5%

图4　0.125g/L粗提毒素37℃作用15min后CD₅₉^＋细胞百分比的改变

表1　毒素作用后正常人、PNH患者、其他非PNH贫血患者

　　的红细胞存留率(±s)

　　注：PNH红细胞的CD₅₉^-细胞率与细胞存留率显著相关，P＜0.01

　　讨论

　　GPI蛋白在正常人血细胞上正常表达，而PNH患者由于造血干细胞PIG-A基因突变，使血细胞质膜表面缺失GPI蛋白CD₅₉、CD₅₅、CD₁₆等，膜表面分子的缺失成为PNH异常血细胞的专有特征^［7］。临床上用流式细胞仪检测CD₅₉^-细胞的存在来诊断PNH，阴性率的高低反映病情的严重程度。

　　嗜水气单胞菌J-1株是从患暴发性传染病的鲫鱼分离到的^［5］。hec毒素是从该菌株培养上清中分离到的相对分子质量为60×10³的单肽，具有溶血性和细胞毒性。其溶血机制是毒素单体与细胞膜表面上的GPI蛋白结合，随后立即聚合成多聚体，插入细胞膜的脂质双层，形成孔洞使细胞渗透压改变而破裂^［4］。

　　我们观察hec毒素对PNH患者和正常人及其他贫血患者红细胞的作用，发现PNH红细胞对hec毒素有特异的抵抗能力，而正常人红细胞和其他非PNH贫血患者的红细胞很快被溶破。其原因是PNH细胞膜表面部分或全部缺失GPI蛋白，hec毒素无从结合到细胞膜上，因此不易破坏无GPI蛋白的红细胞，而正常人及非PNH贫血患者的细胞膜因正常合成GPI蛋白，故对毒素非常敏感。实验最佳条件为粗提毒素浓度0.125g/L，37℃保温20min。将粗提毒素与提纯毒素分别作用于红细胞，发现二者可达到相同的作用，所以可以直接用粗提毒素进行PNH诊断。我们在实验中发现不同PNH患者红细胞的CD₅₉标记率与细胞对毒素的敏感性呈正相关，控制相同的毒素浓度和作用时间，正常人红细胞几乎全被浓解，而PNH患者不被溶破的红细胞占20％～80%，与流式细胞仪测得的CD₅₉标记率相符。当红细胞存留率低于10%时，为避免误诊，须辅以其他PNH诊断方法加以确诊。

　　在已有的诊断PNH的方法中，Ham试验和蛇毒溶血试验敏感度不够高，糖水溶血试验不够特异，流式细胞仪检测比较准确，但因费用昂贵难以推广。hec毒素溶血试验则具有以下优点：①具有很高的特异性，即毒素专一地作用于细胞膜表面有GPI蛋白的细胞。②具有高敏感性，即使缺失CD₅₉的细胞只有10%左右也可查出。③由该毒素作用后细胞存留率与CD₅₉标记率呈负相关，可根据存留率的大小判断PNH病情的严重程度。④比流式细胞仪更准确地反映PNH病情，因为PNH表现为GPI蛋白缺失，但不同细胞系所缺失的GPI蛋白的种类和多少并不相同，而流式细胞仪只是依据CD₅₉的标记率诊断PNH，势必有一定误差。毒素则是特异地作用于所有GPI蛋白，所以不会因不同细胞表达GPI蛋白种类和多少不同而造成误差。⑤操作简单，只需微量红细胞与微量毒素作用很短时间后，测定波长630nm处A值的变化或直接显微镜下计数，即可得到结果。⑥费用便宜。因此，利用hec毒素溶血试验诊断PNH有很大的应用前景。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目（39779334）；卫生部基金资助项目（98-1-025）；北京市自然科学基金资助项目（7982032）

参 考 文 献

　　1，Ham TH. Chronic haemolytic anaemia with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: study of the mechanism of haemolysis in relation to acid base equilibrium. N Engl J Med, 1937, 217:915-918.

　　2，张之南，潘华珍，冯立明，等. 蛇毒因子溶血试验的诊断意义. 中华血液学杂志，1984，5：41-44.

　　3，吕照江，杜涛，张之南，等. 用流式细胞仪检测CD₅₉表型对诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿症的意义. 中华血液学杂志，1997，18：513-516.

　　4，Diep DB, Nelson KL. Glycosylphosphatidylinositol anchors of membrane glycoproteins are binding determinants for the channel-forming toxin aerolysin. J Biol Chem, 1998,273:2355-2360.

　　5，涂小林，陆承平. 嗜水气单胞菌毒素的提纯及其特性分析. 微生物学报，1992，32：432-438.

　　6，Laemmli UK. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bactriophage T4. Nature, 1970, 227:680-685.

　　7，Bessleer M, Mason PJ, Hillmen P, et al. Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH) is caused by somatic mutations in the PIG-A gene. EMBO J, 1994,13:110-117.

(收稿日期：2000-01-17)