慢波睡眠的药理学研究

北京医科大学学报 1999年第3期第31卷 工作综述

作者：库宝善

单位：北京医科大学药理学系，北京　100083

关键词：慢波睡眠☆；睡眠；药物作用；催眠药和镇静药；药理学；失眠症；药物疗法

　　摘　要　睡眠有3种成分：浅睡眠、慢波睡眠（slow wave sleep, SWS）和快眼动睡眠。提出催眠药物开发新构想，即SWS是最重要的睡眠成分，选择性增加深睡眠的催眠药物最重要，它将对改善失眠，辅助治疗焦虑症、抑郁症和痴呆症具有重要意义。近十年研究进展包括：（1）腹外侧视前区-结节乳头体可能是睡眠-觉醒的中枢发生部位。基底前脑吻端pGD₂敏感性睡眠促进区参与睡眠调节；（2）生长激素释放激素、褪黑激素、pGD₂、IL-1和腺苷均可增加SWS。本系神经药理研究室关于SWS的研究工作包括：（1）建立起家兔和大鼠睡眠成分自动分析系统（auto-analysis sleeping stages systems, ASS）;（2）利用ASS研究了免疫增强剂如转移因子、胞壁酰二肽、肿瘤坏死因子，以及5-HT_1A受体激动剂和5-HT₂受体拮抗剂对睡眠成分的影响；（3）探讨5-HT_1A 受体、REM睡眠和5-HT₂受体间的关系。近十年睡眠调节的研究进展证明“构想”的可行性和正确性，并提示，在中枢可能存在免疫增强-TNF增多-5-HT更新率增加-SWS途径。激动5-HT_1A自身受体与拮抗5-HT₂受体有类似效果，二者间有协同作用。开发选择性延长SWS的新型催眠药物可从pGD₂激动剂、腺苷受体激动剂、免疫增强剂、某些激素、和作用于5-HT₂亚型受体的药物入手。

　　中国图书资料分类法分类号　R338.63

Pharmacological study of slow wave sleep

KU Bao-Shan

　　（Department of Pharmacology， Beijing Medical University, Beijing　100083）

　　MeSH　Slow wave sleep^☆　Sleep/drug eff　Hypnotics and sedatives/pharmacol　　Insomnia/drug ther

　　ABSTRACT　 There are three sleeping stages: light sleep, slow wave sleep （SWS）and rapid eye movement sleep(REM sleep). A hypothesis is presented: SWS is the most important one in the sleeping stages. The most important hypnotics will be the drugs selectively promoting SWS. The drugs will be improving insomnia, helping the treatment of anxiety, depression and dementia. The recent decade advances on sleep regulation include the following: （1）Ventrolateral preoptic area-tuberomammillary nucleus (VLPO-TMN) seems to generate sleep and wakefulness . The rostral basal forebrain, which was sensitive to pGD₂, may be involved in regulating sleep. （2）Growth hormone releasing hormone (GHRH), melatonin, prostaglandin D₂　（pGD₂）, IL-1 and adenosine could increase the SWS. Our studies on SWS include the following: （1）Setup the auto-analysis sleeping stages systems （ASS）for rabbits and rats. （2）With the ASS the effects of immune-enhancing substances were studied such as transfer factor, muramyl dipeptide and TNF on sleeping stages in rabbits and the effects of 5-HT_1A receptor agonist and 5-HT₂ receptor antagonist on sleeping stages in rats. （3）Researched the relationship between 5-HT_1A receptor, depriving REM sleep and 5-HT₂ receptor. The recent advances on sleep regulation proved feasibility and validity of the hypothesis. Our results showed the approach： the immune enhancing -TNF increasing -5-HT turnover increasing -SWS. The result of stimulating 5-HT_1A receptor was similar to that of antagonizing 5-HT₂ receptor, and showedsynergistic effects with the both. The development of new type of hypnotics, which selectively prolong SWS, might consider the following clues : pGD₂　stimulators, adenosine receptor agonists, immune-enhancing substances, some hormones and agents influencing 5-HT₂ subreceptors.

（J Beijing Med Univ, 1999,31:204-208）

　　1　催眠药物开发构想的提出

　　睡眠是一种最基本的生理行为，也是保障身心健康的最重要条件，睡眠障碍是常见的疾病和多种疾病伴随症状。睡眠有3种主要成分：浅睡眠、深睡眠又叫慢波睡眠（slow wave sleep, SWS）和快眼动睡眠（rapid eye movement sleep，REM sleep）。研究有关文献发现下述重要现象：脑发育成熟后REM睡眠在睡眠中所占比例比较固定（20％左右），具有不可压缩性，人为减少后（催眠药或剥夺睡眠）会引起强烈“反跳”，其功能与大脑白天获得信息的处理、学习记忆、躯体休息和性功能发育有关。SWS是大脑皮层睡眠（高幅慢波），期间生长激素分泌达最高峰；正常短睡眠者（4～5 h）和普通人（8 h）最大区别在于前者SWS所占比例明显增加（前者40％，后者20％左右）；如果剥夺正常青年人3 d睡眠，恢复自由睡眠后的第一夜主要是SWS“反跳”，第二夜则主要是REM睡眠“反跳”，浅睡眠总量增加并不明显；某些重症神经精神疾病如早老性痴呆、重症焦虑和抑郁症，SWS明显减少甚至完全消失。浅睡眠的重要性则远不及SWS和REM睡眠。

　　镇静催眠药和抗焦虑药是应用最多的药物，作用特点在于使失眠者入睡快，浅睡眠时间明显延长，中间不易醒，但都（95％以上）程度不同地缩短了SWS和REM睡眠。据此，作者于1991年率先提出“催眠药物开发新构想”，即主张开发选择性增加SWS、同时能够保证REM睡眠正常比例的药物，因为这种催眠药物可以更有效地改善睡眠，并且有可能辅助治疗焦虑症、抑郁症和老年痴呆。此构想见文献［1］。

　　2　近十年来SWS研究进展

　　自提出“催眠药开发新构想”后，十分关注SWS研究动态。首先有两个药物，丁螺环酮（buspirone， 5-HT_1A受体部分激动剂）和利坦色林（ritanserin， 选择性5-HT₂受体拮抗剂），可以增加SWS，临床上用来治疗抑郁症和焦虑症^［2］。Sherin等^［3］联合应用逆向示踪剂霍乱毒素B和Fos免疫组化技术，证明腹外侧视前区（ventrolateral preoptic area, VLPO）对结节乳头核（tuberomammillary nucleus, TMN）通过γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA）能神经起抑制作用，而TMN参与上行觉醒系统。Scammell等^［4］在基底前脑吻端的蛛网膜下腔内灌注前列腺素D₂（prostaglandin D₂，pGD₂）后，SWS睡眠明显增加，同时VLPO有强烈Fos表达。那么，从pGD₂激动软脑膜上的受体到VLPO神经元活动增强之间信号传导是怎样的呢？Satoh等^［5］以选择性腺苷A₂受体激动剂CGS21680和拮抗剂KF17837为工具研究证实，pGD₂受体激动后通过诱导软脑膜细胞分泌腺苷来激动邻近的VLPO神经元，抑制TMN觉醒系统，诱发和促进SWS。睡眠与夜间激素分泌之间存在明显相关性，睡眠早期SWS占优势，此时下丘脑-垂体-肾上腺皮质（hypothalamus pituitary adrenal, HPA)轴分泌活动显著低下，生长激素分泌最活跃；睡眠后期则REM睡眠占优势,此时HPA轴分泌最活跃，生长激素分泌低下。研究证明生长激素释放激素（growth hormone releasing hormone, GHRH）和促肾上腺皮质激素释放因子（corticotrop releasing factor, CRF）之间的平衡在睡眠调节中发挥着重要作用，给予GHRH增加SWS，给予CRF则减少SWS^［6］。直接影响睡眠的激素是褪黑激素（melatonin），正常情况下它主要调节睡眠时相，在失眠状态下外源性给予褪黑激素可起催眠作用。值得注意的是β肾上腺素受体阻断剂明显减少褪黑激素的分泌（松果体受交感神经支配，突触后膜为β受体），造成入睡困难、REM睡眠和SWS减少及觉醒次数增加，给予melatonin可使之恢复到正常水平^［7］。细胞因子中除早已证明的TNF外，IL-1促进SWS效应倍受重视，而且与pGs有关，在pGD2敏感的基底前脑吻端的蛛网膜下腔灌流IL-1使SWS增加，环氧酶抑制剂双氯芬酸（diclofenac）可以阻断这种效应^［8］。

　　3　为实现“构想”所进行的研究工作

　　3．1　建立睡眠成分自动分析系统

　　此前，国内研究药物的镇静催眠作用，主要采用的实验方法是观察给药后动物（大鼠或小鼠）自主活动是否减少，能否增强戊巴比妥钠在动物的麻醉作用。少见药物对于睡眠成分影响的研究报道。究其原因是国内缺乏睡眠成分自动分析系统（auto-analysis sleeping stages system ，ASS）。要想实现“构想”，当务之急是建立此类系统。

　　3．1．1　家兔睡眠成分自动分析系统　家兔为昼行性动物，夜间睡眠为连续性，头大易于进行实验，通过分析脑电图（electroencephalogram, EEG）、肌电图（electromyogram, EMG）和眼电图（electro-oculogram, EOG）在清醒和睡眠中的变化特点和规律，结合特定药物（中枢兴奋药，有代表性的催眠药等）引起的变化，与航空航天大学计算机专家合作建立起家兔睡眠成分自动分析系统，并对此系统进行了稳定性、可信性和准确性试验（原理见大鼠ASS），作为方法学已发表在1996年的中国药理学通报^［9］。利用家兔ASS，将一昼夜分成4段，每段6h进行记录和分析，发现以16：00～22：00睡眠和觉醒比例最合适进行药物研究。

　　3．1．2　大鼠睡眠成分自动分析系统　本系神经药理研究室(以下简称本室)利用家兔ASS，研究了免疫增强剂对睡眠成分的影响^{［10～12］}。但在研究过程中发现家兔睡眠成分中REM睡眠的比例非常少（不足5％），这样就无法观察药物对其影响，而这种影响又恰恰是临床上绝大多数镇静催眠药最常见的不良反应。因为减少REM睡眠会造成病人白天乏力、注意力不集中，停药后产生强烈“反跳”——出现兴奋、失眠、恶梦等，以致造成停药困难，心血管病人出现意外。

　　国外类似研究多使用大鼠，因其睡眠成分比例及受药物影响等特点与人类相似。困难之处是大鼠为夜行性动物，即使在白天清醒和睡眠也是交替频繁, 呈多相性，不能使用家兔的ASS，必须建立大鼠ASS，以便从多相变化中提取各种成分。

表1　利用ASS记录的家兔清醒和睡眠成分

（16:00～22:00，±s, %, n=6）

Table 1　The waking and sleeping stages recorded by ASS in rabbits

　　（16:00～22:00，±s, %, n=6）

Rabbit no.	Waking	Light sleep	SWS	Total sleep
1	59.8	36.1	4.1	40.2
2	61.8	58.1	6.3	38.2
3	58.1	41.0	0.9	41.9
4	47.0	51.9	1.2	53.0
5	51.8	41.9	6.3	48.2
6	36.6	38.1	25.4	63.4
±s	52.5±9.5	44.5±8.6	7.4±9.1	47.5±9.5

　　大鼠ASS是与清华大学自动控制系合作，采用分析EEG、EOG和EMG的振幅，定出阈值，根据3种睡眠成分和清醒时各种波形特点，设定逻辑判断程序，对ASS进行自动分析。对大鼠ASS进行稳定性试验采用的是同一组动物，不同日期，固定时间进行记录，然后比较所得结果间差异（P均小于0.05）,说明稳定性良好；可信性试验采用的是选择性增加SWS的药物利坦色林，所获结果与国外类似实验进行比较；准确性试验采用的是随机抽样，双盲人工分析与ASS进行比较（以人工分析为100%），结果相似率达85％以上（不同人分析结果可相差10％左右），达到国际同类系统要求的标准。大鼠ASS将作为方法学发表在中国药理学通报。

　　3．2　药物对睡眠成分的影响

　　3．2．1　免疫增强剂对睡眠成分的影响

　　神经系统与免疫系统间相互影响，表现在细菌和病毒感染后在激活机体免疫系统的同时也促进睡眠；在睡眠过程中免疫功能会出现规律性变化^［13］。

　　实验动物：BALB/c雄性小鼠和雄性家兔两种动物，免疫增强剂：为异丙肌苷（isoprinosine）、转移因子（transfer factor）和胞壁酰二肽（muramyl dipeptide,　MDP），其中MDP本室已证明了其免疫增强作用^［14］，采用家兔ASS分析睡眠成分变化^［9］，³H-TdR掺入法测定淋巴细胞增殖，ELISA测定TNF含量，小鼠胸腺细胞掺入法测定IL-1活性。目的是确认3种药物是否有免疫增强作用，是否影响睡眠成分，特别是SWS。结果如下：

　　异丙肌苷25和50 mg·kg^－1×7d,ip 均明显延长戊巴比妥诱导的小鼠睡眠时间（P＜0.01）；增强ConA诱导的淋巴细胞转化和LPS诱导的淋转（均P＜0.01）；促进腹腔巨噬细胞分泌IL-1（P＜0.01）；促进腹腔巨噬细胞分泌TNF（P＜0.01）。

　　转移因子（4mg·kg^－1，sc隔天一次，共2次），给药前后家兔血单核细胞ConA诱导的淋转（11646±1087, 20940±1934,P＜0.01）,LPS诱导的淋转（6683±880,16558±1512,P＜0.01）；对睡眠成分影响见表2。

　　MDP（100μg·kg^－1,iv）使小鼠血清TNF质量浓度由对照的（0.24±0.21)　mg·L^－1升至（1.62±0.46)mg·L^－1（P＜0.01）,使脑内TNF含量由对照的(17.8±2.4)　mg·L^－1升至（37.4±9.1)　mg·L^－1（P＜0.01）；对睡眠成分的影响见表2。

表2　转移因子（sc）和胞壁酰二肽（ip）

　　对家兔睡眠成分的影响（16：00～22：00，±s,　n=5）

Table 2　The effects of trasfer factor（sc） and MDP（ip）

　　on sleeping stages in rabbits（16：00～22：00，±s,　n=5）

　　△P＜0.05, △△P＜0.01 compare with the results before administration (ignoring REM sleep because only a small percent in rabbits）, NS, normal saline.　　结果表明3种免疫增强物质在增强免疫功能的同时增加了睡眠，特别是转移因子和胞壁酰二肽明显增加家兔的SWS，对浅睡眠没有明显影响。本研究结果发表在中国神经免疫学和神经病学杂志^［10］。

　　3．2．2　肿瘤坏死因子对睡眠成分影响及机制分析

　　分析上述免疫增强剂增加睡眠及增强免疫之间关系时，发现TNF是一重要中介因子^［12］。文献虽已经报道TNF可以增加SWS，但缺乏机制研究。本研究利用家兔ASS分析TNF对睡眠成分的影响，同时利用荧光法测定脑内单胺类神经递质的含量。结果证明TNF剂量依赖性地增加了SWS（3.75 U·kg^－1和7.50 U·kg^－1,iv，给药后6 h内分别增加了14.3±6.9，21.3±7.4，与给药前比 均P＜0.01） 。脑分区测定单胺神经递质含量发现，TNF主要增加大脑皮层5-HT和5-HIAA含量（均P＜0.01）。结果提示在中枢可能存在这样一条途径：免疫增强物质→TNF增加→大脑皮层5-HT更新率增加→SWS增加。本研究结果已发表在神经科学杂志^［11］。

　　3．2．3　5-HT_1A受体激动剂和5-HT₂受体拮抗剂对SWS的影响

　　既然皮层5-HT与SWS有关系，那么研究5-HT亚型受体功能与睡眠成分间关系则是顺理成章的事。通过分析脑内存在的5-HT受体亚型，发现与睡眠关系最为密切的是5-HT₁受体和5-HT₂受体。国外报道激动5-HT_1A受体或拮抗5-HT₂受体均可以明显增加深睡眠。

　　本研究目的：一 是想进一步验证大鼠ASS的可靠性，采用了重复文献相同的药物5-HT_1A受体激动剂8-OH-DPAT和5-HT₂受体拮抗剂ritanserin，将所获结果进行比较；二是想探讨能否通过同时激动5-HT_1A受体和拮抗5-HT₂受体来更有效地增加SWS。实验动物用雄性Wistar大鼠，实验药品ritanserin和8-OH-DPAT，每日10：00～16：00点进行记录，应用大鼠ASS进行分析（以占总记录时间的百分比表示）。

　　不同剂量的5-HT_1A激动剂8-OH-DPAT（Sc）,5-HT₂受体拮抗剂ritanserin（ip）,以及二者联合用药对大鼠清醒及睡眠成分的影响，结果见表3。

表3　8-OH-DPAT (sc), ritanserin（ip）及二者联合应用对大鼠清醒及睡眠成分的影响

　　（10：00～16：00，％，±s,　n=10）

Table 3　Effects of 8-OH-DPAT（sc）, ritanserin（ip）and combination of both

　　on the waking and sleeping stages in rat（10：00～16：00，％，±s,　n=10）

　　*P＜0.05, **P＜0.01, compared with NS group; NS, normal saline.　　从结果可以看出：低剂量5-HT_1A受体激动剂8-OH-DPAT（0.01mg·kg^－1，sc）可以明显减少清醒，增加浅睡眠和SWS，但不影响REM睡眠；高剂量8-OH-DPAT（0.38mg·kg^－1，sc）则明显增加清醒比例，而显著减少各种睡眠成分的比例。Ritanserin（0.63mg·kg^－1,ip）可以显著增加SWS，减少REM睡眠,而清醒和浅睡眠没有显著性改变。低剂量8-OH-DPAT与ritanserin联合给药可以明显的增加SWS和浅睡眠，明显减少清醒和REM睡眠，尤其对后者显示出协同作用。

　　所获结果的解释：5-HT_1A亚型受体部位不同,功能有差异，对药物敏感性也不同。在中缝核的5-HT能神经突触5-HT_1A作为自身受体，调节5-HT神经元的放电；而在边缘系统则作为突触后受体。这两类不同功能的5-HT_1A亚型受体均可被8-OH-DPAT激动。激动突触后5-HT_1A受体需用高剂量8-OH-DPAT，引起活动增多和刻板行为等；而激动突触自身受体只需低剂量8-OH-DPAT，引起活动减少、体温降低等^［15］。

　　Ritanserin是5-HT₂受体拮抗剂中选择性较强、亲和力较高的一种，在大鼠0.63mg·kg^－1（ip）对睡眠影响最明显，故本研究采用此剂量。本实验结果与文献［16］的报道一致，即给予5-HT₂拮抗剂ritanserin后大鼠SWS明显增加，REM睡眠明显减少。

　　3．3　激动5-HT_1A受体和剥夺REM睡眠对5-HT₂受体的影响

　　原希望激动5-HT_1A受体同时拮抗5-HT₂受体可以选择性增加SWS，为实现“构想”找出一条可行之路。结果却显示，随着SWS增加REM睡眠显著减少。SWS增加是所希望的，而REM睡眠减少则是极力要避免的。但这一结果却暗示5-HT_1A受体、REM睡眠和5-HT₂受体之间存在着内在调节关系。

　　本研究是要观察激动5-HT_1A受体和剥夺REM睡眠对5-HT₂受体功能的影响。在大鼠皮下注射高剂量（0.38mg·kg^－1）或低剂量（0.01mg·kg^－1）5-HT_1A激动剂8-OH-DPAT1h后，及剥夺大鼠REM睡眠24h（水上平台法）后，立即制备大脑皮层受体蛋白，用［³H］-ketanserin作配体进行5-HT₂受体结合实验，求出Kd值和Bmax值。

　　结果表明：皮下注射低剂量和高剂量8-OH-DPAT，均使大鼠皮层5-HT₂受体Kd、Bmax值下降（相应为－53％、－30％和－51％、－45％）。说明激动5-HT_1A受体不论激动剂的剂量如何，对5-HT₂受体的影响是一致的，即亲和力（1/K_d）增加和受体数下调，这与不同剂量对睡眠成分的影响不同（见表3）。很可能这种影响是来自于作为自身受体的5-HT_1A受体，而与突触后膜的5-HT_1A受体无关。剥夺大鼠24hREM睡眠后，5-HT₂受体其K_d值（亲和力）无明显变化，而B_max值（受体数）明显增加（＋52％）。

　　根究这一研究结果，可以看出自身受体的5-HT_1A受体激动后通过负反馈作用使5－HT释放减少，效果与拮抗突触后膜的5-HT₂受体是一致的。这就把我们的注意力吸引到5-HT₂受体，特别寄希望于找出分管SWS和REM睡眠的5-HT₂亚型受体和相关化合物。

　　总之，近十年来首先提出了“催眠药开发的新构想”，建立了实现“构想”的有力工具ASS，利用ASS发现免疫增强是选择性增加SWS的一条途径，深入探讨5-HT₂受体亚型功能与睡眠成分关系是又一条途径。国外近十年来的研究进展有力地支持了“构想”的可行性和正确性，并提供了更多的切入点（激素、细胞因子等）。“构想”的实现过程也将会体现出其所带来的经济价值和理论意义。

　　☆　自由词。

　　参考文献

　　1　库宝善.催眠药物开发新构想.生理科学进展，1992，23：107-109

　　2　MARTINDALE． The extra pharmacopoeia. London: Reynolds, Royal Pharmaceutical Society, 1996. p681, 735

　　3　Sherin JE, Shiromani PJ, McCarley RW, et al. Activation of ventrolateral preoptic neurons during sleep.　Science,　1996, 271:216-219

　　4　Scammell T, Gerashchenko D, Urade Y, et al. Activation of ventrolateral preoptic neurons by the somnogen prostaglandin D2. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95:7754-7759

　　5　Satoh S, Matsumura H, Suzuki F, et al. Promotion of sleep mediated by the A_2a-adenosine receptor and possible involvement of this receptor in the sleep induced by prostaglandin D₂ in rat. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:5983-5984

　　6　Opp M, Obal F, Krueger JM. Corticotrophin - releasing factor attenuates interleukin -1 induced sleep and fever in rabbits. Am J Physiol, 1989,257:R528-535

　　7　Van Den Heuvel CJ, Reid KJ， Dawson D. Effect of atenolol on nocturnal sleep and temperature in young men, reversal by pharmacological doses of melatonin. Physiol Behav, 1997,61:795-802

　　8　Terao A, Matsumura H ,Saito M. Interleukin - 1 induces slow wave sleep at the prostaglanding D₂-sensitive sleep-promoting zone in the rat brain. J Neurosci, 1998, 18:6599-6607

　　9　李树新，李中华，库宝善.家兔睡眠时相自动分析方法的建立.中国药理学通报，1996，12 ：429-430

　　10　李树新，库宝善，林志彬.免疫增强剂对动物睡眠的影响.中国神经免疫学和神经病学杂志，1997，4：168-170

　　11　李树新，库宝善，李中华,等.肿瘤坏死因子对睡眠的影响及机制分析.神经科学，1997，4：157-160

　　12　李树新，库宝善，林志彬.胞壁酰二肽对睡眠的作用及其与TNF关系.北京医科大学学报，1996，28：259-261

　　13　Moldofsky H,　Lue FA,　Eisen J,　et al.　The relationship of IL-1 and immunefunctions to sleep in humans. Psychosom Med,　1986,48:309-312

　　14　Li SH, Ku BS, Lin ZB.　The neuro - immunomodulation effects of muramyl dipeptide. Chin Pharmacol Bull,　1994，10:5-8

　　15　Monti J M.Depletion of brain serotonin by 5,7-DHT: efects on the 8-OH-DPAT-induced changes of sleep and waking in the rat. Psychopharmacology,　1994，115:272-277

　　16　Bjorvatn B, Ursin R. Effects of zimelding, a selective 5-HT reuptake inhibitor, combined with ritanserin, a selective 5-HT₂ antagonists, on waking and sleep stages in rats. Behav Brain Res, 1990，40：239-246

(1999-03-30收稿)