补肾益智方对老年性痴呆大鼠突触传递长时程增强的影响
广州中医药大学学报 2000年第2期第17卷 老年性痴呆防治研究
作者：饶燕 赖世隆 胡镜清 王奇
单位：广州中医药大学老年脑病研究所中心，广州 510405
关键词：阿尔茨海默病；中药疗法；痴呆；老年性；中药疗法；补肾药；治疗应用；@补肾益智方；药理学；海马；药物作用；突触传递；药物作用；疾病模型；动物；大鼠
摘要：观察补肾益智方(蛇床子、枸杞子、女贞子、人参等组成)对老年性痴呆(又称阿尔茨海默病，Alzheimer's disease,AD)模型大鼠突触传递长时程增强现象(long_term potentiation,LTP)的影响，旨在探讨该方治疗AD作用的神经生物学机制。应用D-半乳糖致亚急性衰老合并Meynert基底核损毁建立AD模型大鼠，用补肾益智方对AD大鼠灌胃治疗4周，采用电生理学方法，检测大鼠海马齿状回强直刺激诱发的LTP的变化。结果表明：强直刺激后，各组间兴奋性突触后电位增强差异不明显(P＞0.05)，补肾益智方高、低剂量组群体峰电位幅度增强较模型组明显提高(P＜0.01或P＜0.001)。提示补肾益智方对AD大鼠齿状回LTP具有改善作用。
中图分类号：R749.1+6 文献标识码：A
文章编号：1007-3213(2000)02-0109-04
学习记忆能力的损害是老年性痴呆(又称阿尔茨海默病，Alzheimer's disease,AD)患者重要的病理生理特点，至今对其仍无有效防治措施。本研究在采用现已公认的D-半乳糖致亚急性衰老作用［1］形成脑老化的基础上，再以鹅膏蕈氨酸(ibotenic acid,IBO)损毁Meynert基底核(nucleus basalis of Meynert nbM)［2］建立AD大鼠模型，观察补肾益智方对该AD模型大鼠海马齿状回突触传递长时程增强(long_term potentiation,LTP)的改变，旨在探讨补肾益智方的作用机制。
1 材料和方法
1.1 材料
IBO，sigma公司产品；D_半乳糖，上海试剂二厂；石杉碱甲，上海红旗制药厂(批号为970101)；补肾益智方，由蛇床子、枸杞子、女贞子、人参等组成，经广东省中医院制剂室制成1.2kg/L浓缩液。
1.2 分组、造模与给药
20月龄老年Wistar大鼠60只，分为老年正常对照组(N=10，简称正常组)和造模组(N=50)，造模结束后，存活的35只造模组大鼠再随机分为模型对照组(N=10，简称模型组)、补肾方高剂量组(N=9，简称高剂量组)、补肾方低剂量组(N=8，简称低剂量组)和石杉碱甲对照组(N=8，简称石彬碱甲组)。所有大鼠均由广州中医药大学实验动物中心提供。
造模组大鼠腹腔注射D-半乳糖6周(48mg·kg-1.d-1)，然后用IBO(5μg/μL)损毁双侧nbM［3］。手术后1周，高剂量组和低剂量组大鼠分别灌胃高、低剂量的补肾益智方(相当于生药6g·kg-1.d-1和生药3g·kg-1.d-1)，石杉碱甲组以石杉碱甲灌胃(0.3mg·kg-1.d-1)，均连续灌胃4周。正常组均以生理盐水进行腹腔和脑内注射作为对照。
1.3 电生理学
灌胃结束后，大鼠再以戊巴比妥钠(35mg/kg)麻醉，固定于脑立体定位仪之上进行电极埋植手术。记录电极植于齿状回颗粒细胞层，刺激电极植于内嗅皮层穿通通路(perforant path,PP)，参考电极为固定在颅骨上的小螺丝钉。记录电极和刺激电极均缓慢插入，直到选一固定强度而能记录出最大群体峰电位(population spike,PS)的部位。检测刺激为单个方波，波宽0.1ms，选取能诱发最大PS幅度1/2～1/3的强度。当PS值稳定于基线至少15min后给予强直刺激(tetanic stimulation,TS)诱发LTP。强直刺激结束后，每隔3min检测1次PS，电位叠加4次平均，记录时间持续120min，电位由屏幕显示、检测，以PS峰值和兴奋性突触后电位(excited postsynaptic potentials,EPSPs)斜率作为评价指标，以PS的强直刺激前后电位比p(υps，i/υps，f)的百分率来反映LTP的变化。
1.4 统计学处理
实验结果以平均数±标准差(
±s)表示，多组比较用F检验，组间两两比较用q检验，采用SAS6.12统计软件包进行分析，显著性水平取α=0.05。
2 结果
2.1 PS增强的比较
强直刺激穿通通路后，PS的初潜期和峰潜期都比刺激前缩短(表1)，但各组间初潜期和峰潜期刺激前后相比较差异不明显(P＞0.05)，图1为正常组大鼠强直刺激前后诱发电位原始记录。
左：强直刺激前；右：强直刺激后
图1 强直刺激前后正常组大鼠诱发电位示例
表1 强直刺激前后各组间PS初潜期和峰潜期的比较(±s)
| 组 别 |
N/只 |
tPS初潜期/ms |
tPS峰潜期/ms |
| 强直刺激前 |
强直刺激后 |
强直刺激前 |
强直刺激后 |
| 正常组 |
10 |
3.60±0.25 |
3.21±0.29 |
4.50±0.31 |
4.21±0.46 |
| 模型组 |
10 |
3.68±0.23 |
3.36±0.13 |
4.72±0.32 |
4.37±0.30 |
| 高剂量组 |
9 |
3.62±0.12 |
3.35±0.24 |
4.80±0.22 |
4.34±0.31 |
| 低剂量组 |
8 |
3.63±0.14 |
3.27±0.10 |
4.75±0.17 |
4.37±0.27 |
| 石杉碱甲组 |
8 |
3.71±0.22 |
3.31±0.25 |
4.55±0.34 |
4.22±0.28 |
强直刺激后各组动物PS幅度的增加都能超过20%，表明各组动物海马齿状回都有LTP的形成，但方差分析表明各组间PS幅度增强差异有显著性(F=15.826，P＜0.001)。两两比较发现，模型组虽然有一定的增强，但相比正常组大大降低(P＜0.01，见表2)，高剂量组、低剂量组强直刺激后PS幅度增强明显大于模型组(P＜0.01和P＜0.001)，石杉碱甲组相比模型组也明显增强(P＜0.01)；高剂量组、低剂量组与石杉碱甲组和正常组之间比较，PS的幅度差异不明显。从时程观察(见图2)，模型组在强直刺激后的90min内PS幅度的增强都能超过20%，但随后一直低于20%，表明模型组LTP的维持能力下降；低剂量组在强直刺激后的36min内，PS峰值的增强明显大于正常组(P＜0.01或P＜0.05)，此外，强直刺激后21min内，低剂量组与高剂量组、石杉碱甲组与正常组之间PS幅度增强差异有显著性(P＜0.05)。
2.2 强直刺激后各组EPSPs增强的比较
强直刺激后，各组动物EPSPs的增强均比PS的增强要小(表2)，模型组EPSPs的增强低于其他4组，但各组之间并无显著性差异(F=8.57，P＞0.05)。
表2 强直刺激后各组PS幅度和
EPSPs斜率增强的比较
| 组 别 |
N/只 |
pps幅度/% |
SEPSPs斜率/% |
| 正常组 |
10 |
158.53±17.98 |
135.10±15.17 |
| 模型组 |
10 |
128.11±4.76* |
117.47±15.30 |
| 高剂量组 |
9 |
163.03±15.71# |
138.28±24.96 |
| 低剂量组 |
8 |
176.85±13.92## |
139.52±16.94 |
| 石杉碱甲组 |
8 |
164.97±29.60# |
140.89±14.89 |
*与正常组比较，P＜0.01；#与模型组比较，P＜0.01，##P＜0.0013 讨论
诸多的研究提示，学习记忆的神经生物学基础是中枢神经系统的可塑性，其中，神经元突触的可塑性又是中枢神经系统可塑性中非常敏感的环节。海马LTP的研究是目前研究与学习记忆有关的突触功能可塑性的热点。LTP现象被认为反映了突触水平的记忆过程，一些损害学习记忆的因素可减低或阻断LTP的形成，而易化LTP的因素或药物能提高动物的学习记忆能力［4］，因此，从学习记忆和突触可塑性变化的关系出发，探查海马突触功能可塑性在AD时的相应变化及治疗药物影响，可能会为筛选有效的改善AD等疾病防治药物的研究提供一个较新的角度，但目前有关这方面的研究还不多。
AD的主要病理特征为脑内出现大量老年斑、神经原纤维缠结以及胆碱能系统逐渐丧失等，其发病机制十分复杂。所以目前制备AD动物模型的方法虽然有多种，但每种方法均只能造成某些方面的病理改变，这种状况为评价治疗AD的药物作用带来不便。为了贴近AD多因素的病理特征，本研究采用D-半乳糖致亚急性衰老(D-半乳糖引起自由基代谢紊乱，使脑组织形态、生化及临床检测指标呈现老化特征［1］)，并以IBO损毁Meynert基底核的胆碱能神经元来建立AD大鼠模型。我们的早期工作已表明［3，5］，该AD模型能呈现多种病理改变，更符合AD多因素的发病机制，是进行有效中药治疗研究的合适模型。
图2 强直刺激后LTP的时程比较
Nalbantoglu等最近的研究表明，表达淀粉样前体蛋白C-末端的转基因AD大鼠不仅空间学习记忆能力受损，而且海马脑片CA1区LTP的维持能力受损［6］。本实验中，AD大鼠海马PP-DG通路诱发的PS峰值虽有一定的增强，但增强幅度大大低于正常组，并且在强直刺激后的120min内PS幅度的增加已经下降到20%以下，表明AD大鼠在体齿状回LTP的产生及维持能力亦显著下降，这与Nalbantoglu等在海马CA1区的研究结果是相似的。本实验结合有关的研究工作表明，突触传递功能可塑性的下降很可能是AD病人学习记忆能力下降的原因之一。
补肾益智方高、低剂量组和石杉碱甲组大鼠海马齿状回产生的LTP均比模型组显著提高，提示补肾益智方和石杉碱甲具有改善AD大鼠突触传递的能力，说明补肾益智方的组方切中AD的肾虚、气血不足的病理机制，具有补肾填精、益髓健脑、益气养血活血之效能。我们以前的研究提示，补肾益智方能够保护AD模型鼠脑内胆碱能系统，该方灌胃组大鼠脑内胆碱酯酶(AchE)阳性神经纤维密度呈现广泛和非特异性增高［3］，胆碱能系统在LTP及学习记忆中的作用已被一些研究所证实，海马CA1和齿状回的LTP可被东莨菪碱抑制，而胆碱酯酶则能增强LTP［7］。据此推测，本实验中补肾益智方改善AD大鼠LTP的形成与影响胆碱能系统的功能有关。尤其值得注意的是，在强直刺激后的30min左右时间，低剂量组和石杉碱甲组PS的增强明显大于其他各组，可能低剂量的补肾益智方和石杉碱甲在易化短时程增强方面具有明显的作用，但具体的机制目前还不清楚，需要进一步研究。
基金项目：国家“九五”科技重点攻关项目(NO：96-906-09-02)；国家医药技术创新博士项目(NO：98-B-13)
作者简介：第一作者，饶燕 女，1972年8月出生，硕士，助教；
参考文献：
［1］张熙，张葆樽，杨新平，等.D-半乳糖诱导拟衰老动物模型的记忆行为改变［J］.中国老年学杂志，1996，16(4)：230
［2］Rasool CG,Svendsen CN,Selkoe DJ.Neurofibrillary degeneration of cholinergic and noncholinergic neurons of the basal forebrain in Alzheimer's disease［J］.Ann Neurol,1986，20:482
［3］胡镜清，赖世隆，王奇，等.补肾益智方对阿尔茨海默病大鼠模型脑内胆碱能神经系统的保护作用［J］.广州中医药大学学报，1999，16(3)：201
［4］Bliss T V P,Collingridge GL. A synaptic model of memory:long_term potentiation in the hippocampus［J］.Nature,1993，361:31
［5］胡镜清，赖世隆，王奇，等.D-半乳糖加速衰老合并Meynert核损毁大鼠学习记忆能力变化的初步观察［J］.中华老年医学杂志，2000，19(2)：5
［6］Nalbantoglu J,Tirado_Santiago G,Lahsaini A， et al.Impaired learning and LTP in mice expressing the carboxy terminus of the Alzheimer amyloid precursor protein［J］.Nature,1997，387:500
［7］Markevich V,Scorsa AM,Dawe GS， et al.Cholinergic facilitation and inhibition of long_term potentiation of CA1 in the urethane_anaesthetized rats［J］.Brain Res,1997,754(1-2):95
收稿日期：2000-03-09
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