第五节　自然杀伤细胞的检测

　　NK细胞表面至少存在CD2、CD11b、CD11c、CD16、CD56和CD69等多种抗原，但均非NK细胞所特有，因此现今极少以CD系列抗原为指标鉴定和计数NK细胞，而多检测NK细胞活性。NK细胞株作为靶细胞，而测小鼠NK细胞活性则用YAC细胞株，检测方法多种多样，各有其优缺点。

　　（一）形态法

　　检测原则是将效应细胞与靶按一定比例混合共育，继而台盼蓝或伊红Y等活细胞拒染的染料处理，然后分别计数着染的死细胞和不着染的活细胞，由此推算NK的细胞的杀伤活性。本法简便，易于掌握，但判断死细胞与活细胞不免带有检测者的主观因素，也无法计数轻微损伤的细胞。

　　（二）酶释法

　　检测原则是将一定比例的效应细胞和靶细胞共温一段时间后，离心沉淀，取上清液检测靶细胞遭破坏后释放的乳酸脱氢酶或碱性磷酸酶含量。本法经济、快速简便，但可定量。缺点是靶细胞内碱性磷酸酶含量低或因某些未死亡细胞能自行释放，从而影响法灵敏度和特异性。此外乳酸脱氢酶分子较大，仅当靶细胞膜完全被破坏时才释放，故不能较早地反映效应的功能。

　　（三）荧光法

　　检测原则是用荧光素标记靶细胞，经与效应细胞共温后，离心法上清，用荧光计检测剩余的活靶细胞的荧光，缺点是活细胞释放的荧光常被效应细胞和培养液等所粹灭。另外，荧光分析法常遇细胞自然释放率高，荧光本底强，影响灵敏度。为克服上述障碍，用时间分辨荧光免疫分析，将靶细胞用镧系元素铕（Eu³⁺）的螯合物标记，按同法与效应细胞共温后，用时间分辨荧光计检测荧光，可除去非特异性荧光本底。本法实验时间短，效靶细胞仅需共温2h，检测速度快，特异性强。

　　检测原则是将效应细胞和靶细胞按一定比例混合温育后，直接检测靶细胞。分有靶细胞浆释放法和胞核释放法。

　　1．胞浆释放法常用⁵¹Cr释放法。⁵¹Cr透过细胞膜与胞浆中小分子蛋白质结合，一旦细胞膜遭破坏，同位素随蛋白质外溢，并且不会被完整的细胞再度摄入。本法操作简便快速能定量，缺点是自然释放率高，所需靶细胞数量多，⁵¹Cr半衰期短。近年有用¹¹¹In（铟）检测NK细胞活性，优点是标记率高，用量微，以γ射线放射，可释放90％的自身能量，比⁵¹Cr高10倍，自然释放率低，仅为⁵¹Cr的一半。

　　2．胞核释放法常用³H-TdR或¹²⁵IudR作为DNA合成的前体物，可被摄入靶细胞核内。当效应细胞和靶细胞共温后，用胰酸和DNA酶处理可使遭破坏的胞核内容物释放。本法自然释放率比⁵¹Cr低，半衰期较长，方法的敏感性高，故被大多数实验室所采用。

　　（五）化学发光法

　　检测原则是当效应细胞与靶细胞接触时，效应细胞呼吸爆发，生成极不稳定的O₂^－和OH^－等，放出光子，在发光剂存在的条件下，可被电倍增管接受和计数，发光量与NK细胞杀伤能力相关。

　　总之，检测NK细胞活性的方法多种多样，方法的简繁有很大差异，但敏感性和特异性亦异，从简单的活细胞计数直至最先进的流式细胞仪分析，一般可根据实验要求和具体条件选用。

（杨廷彬）