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附录二　原位杂交组织化学常用试剂及处理

 

一、杂交前准备

（一）DEPC水是经DEPC处理过的灭菌蒸馏水。

DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂。原位杂交在杂交及其以前的各步处理中，所有液体试剂都应经DEPC处理。方法是：取市售DEPc 1ml，加入1L待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC（DEPC分解为CO₂和乙醇）。有些试剂可直接加入DEPC，终浓度一般为0.1%～0.4%，原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试剂均需用DEPC处理，或用DEPC水配制，包括乙醇的稀释。此外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需DEPC水洗涤。

注意：①DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。②含有Tris缓冲液的溶液中，不能加入DEPC。

（二）载玻片的处理

组织原位杂交，常在载玻片上进行，故载玻片的洗涤至关重要，必须保持清洁，并且不能有任何核酸的污染。处理方法如下：

（1）先经洗衣粉浸泡过夜，次日自来水冲洗后，泡酸数小时以上，取出后再用流水冲洗，双蒸水冲洗2～3次，置160℃以上烤箱中烧烤4h以上，或经15磅高压灭菌20min。经以上处理可清除载片上的核酸酶。

（2）HCl处理法

（三）硅化

【方法１】（1）将一扎新的盖玻片散开，在通风条件下于0.1mol/L的HCI中煮20min,等其冷却后,倒掉盐酸。

（2）用去离子水沉漂洗玻片，竖放在架子上自然干燥。

（3）硅化盖玻片：通风条件下，将单块的盖玻片在二甲二氯硅浣（dimethyldichorsilane,DMDC）液中浸几下，竖入在架子上干燥。

（4）收集干燥的盖玻片于一可耐热的petri氏盘（或培养皿）中，用去离子水漂洗数次，彻底清洗。

（5）用铝箔将装有盖玻片的培养皿包好，于180℃烘烤4h过夜。取出待冷至室温后，即可进行后续处理。

附：2%DMDC

配制：按比例两者充分混匀，静止待气泡消失即可使用。

用途：硅化玻片（载片、盖片均可）。

【方法2】将经过洗净的玻璃盖片分散开放在一金属网中，并将该网放入一接有真空泵的干燥器中。同时，在干燥器中放一盛有约1m二甲二氯硅浣（dimethyldiorosilane,DMDC）的小烧杯。盖好干燥器（确保密闭），抽真空约5min，然后让空气冲入。取出盛有盖片的金属网架，用锡箔纸包埋，于250℃以上烘烤4h以上，最好过夜。冷却后备用。

本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于60℃烧干。

【方法3】APES（氨丙基三乙氧基硅浣）法

【方法4】

（1）49ml氯仿与1mg二甲二氯硅浣（DMDC）配液；

（2）倒入每个拟硅化的试管或离心管中，浸泡5min后用乙醇或重蒸水冲洗；

（3）玻璃器皿使用前位于180℃以上烘烤2h以上，塑料器皿应于60℃烘烤过夜。

注意：DMDC有毒且高度挥发，应于通风环境操作并戴口罩、手套，避免接触皮肤或吸入。

（四）载片的包被（粘贴）

１．沾附剂

（1）多聚赖氨酸(poly-L-Lycine,PLL)

储备液（0～5%）

按上述剂量充分混合，即为浓度为5mg/ml(0.5%)的PLL液。常分装成1ml的包装，-20℃存放。该液为储备液，可反复冻融，无明显影响。用前充分混合。

工作液（0.01%）：

充分混合，静止待气泡消失。

（2）明胶液

配法：先称取明胶溶于500～800ml DEPC水中，加热搅拌助溶，待明胶完全溶解以后，加入甲明矾溶解后即可使用。注意，包被玻片时，明胶液温度最好保持在60℃左右，效果最佳。方法同PLL包被玻片。

2．多聚赖氨酸包被玻片的制备方法（其它包被剂相同）

（1）将事先准备好的经160℃以上烘烤，并冷却至室温的玻片（载片或盖片），在0.05%（也有用0.1%）的PLL液中上下浸蘸几下，分散开竖放在架子上，于空气中自然干燥，4℃备用。注意：①浸蘸时，务必使整个玻片完全浸于液体中，否则，包被不完全会产生标本脱落现象；②干燥过程中注意避免尘埃污染；③按上法处理的玻片通常可存放在一定时间（室温1月以上，4℃更长），但仍建议尽早使用。

（2）多聚赖氨酸1mg溶于10ml灭菌的去离子水或1mmol/L的Tris-HCl缓冲液中（pH7.0），将其涂布于玻片上，待干燥后即可使用。该法包被的玻片可用于细胞涂片和切片。

（3）将PLL工作液滴至盖玻片上5μl/片，用另一盖玻片以推血涂片方法推片，或用另一盖玻片紧贴于其上，相互磨擦以使两盖玻片相对的一面涂布上PLL。该法制备的玻片，只有一面是包被有PLL，故制备时，待其晾干后，应作好记号，然后保存后备用。

多聚赖氨酸可用于多种核酸杂交，方法简单，结果可靠，有许多其它方法不可比拟的优点。配制好的液体可存放于4℃或室温，但时间过长会解聚而失效，故建议使用时尽量新鲜配制。

（4）Vectabond粘附剂

该试剂是Vector公司新近推出的一种新型粘附剂。它与其它粘附剂的主要区别是：一般的粘附剂是通过物理性覆盖在玻片表面，天长日久，可能由于包被不完全或局部脱落而致切片等标本易于脱落。而Vectabond试剂是通过化学性作用，改变玻璃表面的分子结构，使标本贴附牢固，不易脱落，且保持时间长久，耗量小，价格便宜，一个包装7ml可配成350ml工作液使用。操作程序：

标本（铺片、切片等）→丙酮（5min）→Vectabond试剂工作液（5min）→dH₂O(2×5min)→干燥（温箱，数小时过夜）→用铝箔包好，室温备用。

注意：制备和保存过程中避免污染。

经上述处理的载玻片一般可存放半年以上（4℃可更长）。

（五）硅鱼精子DNA的制备

（1）在50ml灭菌聚乙烯管中加入1g鲑精DNA，加入15ml DEPC水使其浸泡5min至2h；

（2）加入2.5ml 2mol/L HCl，室温放置，DNA形成白色沉淀，充分振摇至沉淀物相互缠绕在一起，用吸头尖端使之形成一球团状（2～3min）；

（3）加入5.0ml 2mol/L的NaOH。摇动小管使DNA悬浮、溶解，将小管置50℃15min助溶；

（4）用DEPC水将混合物稀释至175ml（总体积），充分混合，注意确保管内已无颗粒状；

（5）加入20ml/l 1mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH7.4）；

（6）用2mol/L的HCl滴定至DNA溶解pH为7.0～7.5；

（7）用无菌微孔滤膜过滤液体，去除颗粒。260nm测定溶液的OD值，方法是：取20μl DNA液混合于980μl水中，混匀后测定，吸收值乘以50即为DNA浓度（μg/ml）；

（8）制备好的DNA液储于-20℃备用，用前取出冻融后煮沸。

 

二、关于探针的标记

（一）cRNA探针的同位素标记

1．标记液（转录标记）

2．转录缓冲液

※：用地高辛或生物素标记时，用UTP替代。

3．标记终止液

4．标记探针水解液

先用dH₂O悬浮探针，再加入后两种试剂，轻轻振摇混合，于60℃条件下反应。

5．探针水解时间

注：L_O－探针初始长度（kb）

L_f－探针的终长度（kb）

K－0.11kb/min

6．探针水解终止液

每次加入充分混合，临用前配。

7．探针沉淀液

每次加入，充分混合，新鲜配制。

（二）寡聚核苷酸3’端标记（cRNA探针）

1．标记反应液

2．终止液：0.2mol/L EDTA

3.探针沉淀液

（三）cRNA探针非同位素标记（地高辛及生物素）

1．标记液

△：生物素标记时为10mmol/L的生物素-11-UTP

※：为检测标记率而加。

2．转录标记终止液

（1）0.2mol/L EDTA：用于地高辛标记法

（2）生物素标记终止液：

（四）DNA探针标记常用试剂的配制

（1）10 ×缺口平移缓冲液：200mmol/l Tris-HCl,pH7.4含50mmol/L MgCl₂;100mmol/Lβ-巯基乙醇、1mg/ml BSA。

（2）缺口平移反应终止液：200mmol/L NaCl;10mmol/l Tris-HCl,pH7.4;11mmol/L EDTA; 0.5% SDS。

（3）DNaseⅠ:干粉状DNaseⅠ(2000～3000u/mg)溶于20mmol/l Tris-HCl, pH7.5中（1mg/ml）,10μl分装，-20℃保存一年。

（4）10×DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）缓冲液：500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L Mg－Cl₂;10mmol/L DTT;0.5mgBSA。

（5）10×激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl₂;20mmol/LDTT; 1.0mmol/L亚精胺。

（6）10×随机引物标记缓冲液；500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl₂;10mmol/Lβ-巯基乙醇；500μg/ml BSA。

（7）1×加尾缓冲液：100mmol/L二甲胂化钾，pH7.0,1mmol/l CoCl₂0.2mmol/L DTT。

（8）1mol/L MgCl₂:MgCl₂47.60g溶于500ml水中，100ml分装，高压灭菌，室温保存。

（9）0.25mol/L EDTA(Ph8.0):EDTA 52.02g溶于400ml水中，调pH至8.0，加水至500ml，100ml分装，高压灭菌，室温保存。

（10）4mol/L醋酸钠：取无水醋酸钠82g溶于200ml水中，用醋酸调pH至6.5，加水至250ml，高压灭菌，或0.45μm膜过滤，室温保存。

（11）10% SDS：10g SDS（十二烷基硫酸钠）溶于50ml水中，加水至100ml，分装后室温保存。

（12）20×SSC：取NaCl 175.3g;柠檬酸钠88.2g;加水至1000ml，用10mol/l NaOH调pH至7.0；高压灭菌，室温保存。

（13）无菌水：100ml去离子水或双蒸水，分装，高压灭菌，室温保存，开瓶后仅限一周使用。

（14）10×激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgCl₂;50mmol/lDTT;10mmol/L亚精胺（非必需）。

（15）T₄多聚核苷酸激酶：10u/μl，保存在甘油中，-20℃。

（16）TE缓冲液（Tris/EDTA）：Tris,10mmol/l pH7.4(0.5ml 2mol/L贮存液)，1.0mmol/l ED－TA,pH8.0(20μl 0.5mol/L)贮存液，加水至100ml，室温保存。

（17）2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g溶于850ml，加浓HCl 75ml ,边加边缓慢搅动，至pH7.4,于加水至1000ml。

（18）1mol/L DTT(二硫苏糖醇)：3.0g DTT溶于20ml水中，分装，于-20℃贮存。

（19）0.5mol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）：在烧杯中先加入300ml水，加入93.5g EDTA－Na₂·2H₂O,充分混匀，加10mol/l NaOH调pH至8.0,加水至500ml。

（20）10mol/L NaOH：200g NaOH溶于450ml水中，混匀，再加水至500ml。

（21）5mol/L NaCl：292.25g NaCl,加水至1000ml。

（22）1mol/L HCl：加86.2ml浓盐酸至913.8ml水中。

（23）1mol/L CaCl₂：147g CaCl₂：2H₂O,溶于1000ml水中,高压灭菌,室温保存。

 

三、固定剂

进行原位杂交的组织或细胞标本常需经固定处理。尽管许多化学物质对组织/细胞有固定作用，但核酸原位杂交的理想固定液应具备如下特点：①能很好地保持组织细胞的状态；②对核酸无抽提、修饰及降解作用；③不改变被检核酸分子在组织细胞内的定位；④对核酸及探针的杂交过程无阻碍作用；⑤固定液本身对杂交信号无遮蔽、掩盖作用，如不使本底增加等；⑥理化性质稳定、价格低廉。

1．4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA）

配法：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml 2×PBS^※，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。

注意：①配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因PFA有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用；②加热时，温度不宜过高，常为60～65℃，否则，PFA降解失效；③配制好的PFA虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，建议尽早使用。

附：固定液用PBS的配制：

配法：按上述比例称取试剂，溶于DEPC水（也可用蒸馏水加DEPC）500～800ml中，过滤后，加水定容至1000ml，高压灭菌。通常配制成10×PBS的储备液，2×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。

除用DEPC水配制PFA外，也有用灭菌蒸馏水或经DEPC处理的0.01～0.1mol/L的PBS配制的，方法及注意事项同上。

4% PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保持组织及细胞内的RNA，同时对形态保持也较好。通常组织块固定4～12h，载片固定时间在10～15min以内，RNA含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。

2．甲醛

①10%甲醛（Formaldehyde,FA）

量取二者充分混合而可。较适于检测RNA的组织及细胞固定，也可用于新鲜冰片切片后固定。

②10%福尔马林试剂：

较适于固定细胞。

③10%中性福尔马林

市售甲醛　100ml

Na₂HPO₄4g

NaH₂PO₄6.5g

DEPC水　～1000ml

常用于石蜡样品切片的固定。

10%的甲醛由于有促进DNA双链分子交联的作用，干扰DNA变性，故不适于DNA杂交。在组织或细胞原位杂交中，可通过使用含50%甲酰胺的杂交液使DNA变性解链而解决。这类固定液在DNA/RNA杂交中有较好的效果。

3．4%戊二醛效果较40%差。

4．0.1%戊二醛常用于固定组织，适于新鲜组织冰冻切片及石蜡切片的后固定，常用于检测DNA的原位组织杂交方法。

5．乙醇/醋酸（或冰醋酸）将乙醇与醋酸按3：1的体积比充分混合即可。该液较适于固定细胞的原位杂交，尤其检测DNA时。

乙醇/醋酸虽广泛应用于原位杂交中，但RNA保留较差，可本底很低，即背景染色淡。

6．甲醇/醋酸（3：1）用前按体积比3：1比例充分混合即可。

7．甲醇/丙酮（1：1）适于培养细胞的原位杂交技术。

8．4%多聚甲醇-0.5%～1%戊二醛溶液在pH7.4磷酸缓冲液中，用于免疫电镜样品固定。

 

四、LB培养基

（一）液体LB培养基（Luria-Bertani培养基）

配制：取一1000ml的烧杯，将事先称取好的试剂加入杯内，加H₂O约500～800ml搅拌使其溶解完全。用5N的NaOH调pH至7.0,加入H₂O定容至1000ml。15磅高压灭20min。

（二）琼脂糖平板培养基

细菌培养用琼脂（或琼脂糖）15g

液体培养基（如LB）～1000ml

按浓度比例，将琼脂加入液体培养基（如LB）中，稍加搅拌，用纱布或纸封好瓶口，15磅高压灭菌20min。

 

五、小量质粒提取主要液体

1．溶液Ⅰ

2．溶液Ⅱ

3．溶液Ⅲ（3mol/L醋酸钠）

加热溶解后，再用冰醋酸（约40ml）调pH至4.8，补足H₂O至200ml。

 

六、杂交前处理

1．蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K） 蛋白酶K主要用于杂交前标本处理，其作用是使组织达到一定消化，利于检测分子的穿透，从而提高检测方法的敏感性，但各种组织在不同条件下消化程度不一，因此，具体应用时，应根据组织种类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏，核酸分子也会受到影响。通常是将其配成储备液（1mg/ml），临用前，再配成工作液（约0.025mg/ml）。配制方法：

精心称药，将二者充分混合后，分装成小份，-20℃存放，用时再取出冻融，余者弃去。

（2）工作液（临用前配）：

取储备液（1mg/ml）按1：40稀释，充分混合，即得约含Pro.K为25mg/ml的工作液。

（3）关于P-K缓冲液的配制：

称取上述试剂，充分混合即可。

②1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0)：

先将Tris于800ml ddH₂O中溶解，用HCl将pH调至8.0,ddH₂O定溶于1000ml，高压灭菌，室温备用即可。

③0.5mol/L的EDTA：

称取EDTA溶于约600ml ddH₂O中，常需60℃持续搅拌以助溶，滴加NaOH至pH接近8.0时，EDTA才开始溶解。待完全溶解后，冷却至室温，NaOH调pH至8.0,ddH₂O定溶至1000ml，高压灭菌，室温备用。

2．甘氨酸

（1）1mol/L甘氨酸：

称取甘氨酸75g溶于ddH₂O或DEPC水中，最后补足ddH₂O定容至1000ml，高压灭菌备用。该液为储备液，-20℃储存。

（2）甘氨酸工作液（0.1mol/L）：

将二者按1：10比例稀释，即得甘氨酸工作液。一般要求临用前新鲜配制。

甘氨酸有终止蛋白酶K作用的作用，以防过度消化。

3．0.25%醋酸-0.25%醋酸酐

配制：按上述配方，先以少许DEPC水溶解NaCl，然后加入三乙醇胺及浓HCl。DEPC水定容至约1000ml(997.5ml)，临用前，一边摇动溶液一边加入醋酸酐，充分混合。注意操作时避免浓HCl 溅出，最好在通风条件下进行。

生物体内有些组织，如神经组织中的蛋白质，对带负电荷的核酸探针较易吸附。经该液乙酰化处理后，可使切片标本表现带上负电荷，有排斥带负电的核酸探针，减少非特异吸附，降低反应背景的作用。

4．RNA酶溶液

取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中，分装成小份（1ml,10mg/ml），-20℃储存。

临用前，取RNA酶A储备液，用2×SSC溶解配成工作液（0.01mg/ml）.

5.0.2%

取2ml Triton X-100加入998ml PBS中，充分振荡使其充分混合。

 

七、杂交用液

1．SSC（Standard Saline Citrate, SSC）

通常配成10×，20×，50×的储备液，如下：

配制：先称取上述两种试剂，溶于约800ml ddH₂O中，滴加10N的NaOH，将pH值调至7.0，补足ddH₂O至1000ml，加入终浓度为0.1%～0.2%的DEPC，分装后高压灭菌，可室温保存。

该液主要用于配制予杂交液及杂交后的各种洗脱液，以保持一定的离子强度。此外，在用于杂交的湿盒内也常用5×的SSC以保持一定湿度。

2．Denhardt’s液

通常配成10×，50×或100×的储备液

配制：称取上述试剂，溶于800ml左右灭菌ddH₂O中，定容至1000ml后，过滤后于-20℃保存备用。

该液用于配制杂交液及予杂交液等。

3．杂交液及予杂交液

※：临用前加；△予杂交液不加

配制：先以去离子甲酰胺与SSC于室温混合，加入硫酸葡聚糖于50℃促溶，依次加入其它成份。硫酸葡聚糖在室温常需数小时才能完全溶解。有时需旋涡振荡。定容后充分混合。根据使用方便可分装（最好用铝箔将瓶子包好）存于4℃，可达数月。注意，杂交缓冲液在使用前切忌污染。

变性被打断的无关DNA（常为鲑精DNA或鲱精DNA）可在予杂交及杂交前加入。此外，有许多物质如肝素、多聚腺甘酸、醋酸钠等多种成份，可根据需要加入杂交液中，上述配方所列只是不可缺少的基本成份。

配制好的杂交液不宜反复冻融，否则易产生硫酸葡聚糖沉淀现象。使用前最好加热至50℃，使其充分溶解后再加入探针分子。至于探针的浓度视实验目的、探针类型及标记方法而异。通常RNA探针分子浓度为0.5～2μg/ml，DNA探针浓度为1μg/ml,此外，如使用³⁵S标记的探针，还需加入终浓度为100mmol/L的二硫苏糖醇（Dithiothreitol,DTT）至杂交液及杂交后的洗脱液中。

 

八、杂交后漂洗溶液

无论用何种标记方法及何种信号显示方法，在杂交后洗脱则是大同小异。在此，归纳几种带有共同性及常用的洗脱液。

该液常用于杂交后的初次洗脱，故离子强度（张力）较高。

该液常用于杂交后的第二次洗脱，离子强度较低，经过上述两套洗脱液洗后，有的还可用2×SSC，10%（0.1%）SDS洗脱。

主要是洗去残留的RNA，降低背景。用于以RNA为探针的原位杂交方法中。

4．Dig标记探针杂交后处理液

用ddH₂O溶液并定容至1000ml。

用ddH₂O溶解并定容至1000ml。

配制同上。

左旋咪唑有消除内源性磷酸酶的作用。

 

九、原位杂交信号显示

目前应用原位杂交方法中，信号的显示主要有放射自显影，酶底物及免疫金银等方法，在此归纳有关的主要试剂。

1．A-B显影液

称取上述试剂，按配方分别溶于50ml ddH₂O中，于显影前，在室温将两者（A液及B液）按1：1混合，稍加摇动促进混合，即可将贴有切片标本的切片放入显影液，于室温避光（可暗室）反应5～15min。显影时间和温度相关，需自己根据情况摸索。终止反应只需将显影液倒出，自来水冲洗即可。倒出的AB显影液可暂时不扔，光镜下观察，若明显显影不够，还可重新或继续显影。AB显影液要求临用前配制，在显影时才将AB二液混合。否则，A液过久会产生黄色沉淀，增加背景。

AB液用于免疫金银法中，使金标记颗粒信号放大，形成棕黑色沉淀。

2．DAB-H₂O显色液

配制方法见附录一。

该液用于标本被标记上辣根过氧化物酶（HRP）的方法。产物为棕黄色。

3．NBT-BCIP显色液

配制方法，详见附录一。

该液用于有碱性磷酸酶标记物的方法中。产物为紫蓝色。

4．Kodak D-19显影液

配制：先将500ml水中加温50℃，按上述配方顺序加药，同时充分搅拌，每加一种药完全溶解后，再加另一种药品，否则，所配的显影液易产生混浊而效果差，最后补足水至1000ml充分混合，室温或4℃避光保存。最好包上纸。

该液用于放射自显影时的显影。

5．Kodak F-5定影液（酸性坚膜定影液）

※：28%醋酸为3份冰醋酸和8份水混合液。

配制：同Kodak D-19显影液。