原发性膀胱癌多肿瘤抑制基因1改变及其意义

中华泌尿外科杂志 1998年第12期第19卷 论　著

作者：彭龙开　黄循　杨罗艳　游学科

单位：410011 长沙，湖南医科大学附属第二医院泌尿外科

　　关键词： 膀胱肿瘤；癌；基因

　　摘要　为探讨多肿瘤抑制基因1(MTS1)在原发性膀胱癌发生发展中的作用，采用PCR-SSCP和DNA直接测序方法，对18例膀胱移行细胞癌进行MTS1分析。结果18例原发性膀胱癌中没有发现MTS1纯合性缺失，但发现2例点突变。表明原发性膀胱癌的发生与MTS1的失活相关。

　　Alteration of multiple tumour suppressor 1 (MTS1) in primary bladder cancer　Peng Longkai, Huang Xun,Yang Luoyan, et al. Department of Urology,The Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University,Changsha 410011

　　 　　Abstract　Abstract　Multiple tumor suppressor 1(MTS1), encoding a Mr16 000 protein (p16) ,maps to chromosomal 9p21. The p16 protein inhibit the kinase activity of cyclin D/CDK4 complex and blocks its pregression to S phage, thus inhibiting cell growth and division and blocks the malignant transformation of cell. When p16 gene was inactivated resulting from homozygous deletion or point mutation, its function as a tumor inhibitor will be lost,resuling in tumor development. To elucidate the role of MTS1 gene in tumorigenesis of bladder cancer,18 cases of bladder cancer were analyzed by polymerase chain reaction(PCR),PCR-single strand conformational polymorphism (SSCP) and DNA sequencing. No homozygous deletions were found in the MTS1 gene,while point mutations were found in 2 of 18 bladder cancers. It was concluded that tumorigenesis of primary bladder cancer is correlated with inactivation of MTS1 gene.

　　Key Words　Bladder neoplasms　　Carcinoma　　Genes

　　多肿瘤抑制基因1(MTS1)又称P16基因，位于9p21，编码分子量16 000的蛋白质(P16)。P16蛋白阻止细胞从G1期进入S期，抑制细胞的生长分裂，阻止癌症的发生^［1,2］。研究表明在多种肿瘤细胞中存在着MTS1基因的纯合缺失和点突变^［3～7］。为探讨MTS1基因在原发性膀胱癌发生发展中的作用，对18例膀胱移行细胞癌进行PCR-SSCP和DNA序列分析，以检测原发性膀胱癌MTS1基因纯合性缺失和点突变。

材料与方法

　　一、临床材料

　　18例原发性膀胱癌标本均取自本院1996年4月～1997年1月手术病人。其中开放手术6例，经尿道膀胱肿瘤电切术12例。术后病理诊断均为移行细胞癌。标本均取自肿瘤中央部位。同时取癌旁正常组织或抽取外周静脉血作对照。组织取出立即进行DNA抽提或置－70℃保存备用。

　　二、试剂与仪器

　　1.试剂：脱氧核苷酸(dNTPs)和TaqDNA聚合酶为上海复华公司产品，DNA测序试剂盒为Promega公司产品，［r-³² P］ATP由北京亚辉生物工程公司提供，尿素(超级纯)、丙烯酰胺(测序级)、N，N'－亚甲双丙烯酰胺均为Sigma公司产品。

　　2.引物：(1)PCR扩增引物：外显子1上游P1 5′-GGGAGCAGCATGGGAGCCG-3′，下游P2 5′-AGTCGCCCGCCATCCCCT-3′；外显子2上游P3 5′-GGAAATTGGAAACTGGAAGC-3′，下游P4 5′-TCTGAGCTTTGGAAGCTCT-3′。(2)外显子2测序引物：上游P5 5′-GGCTCTACACAAGCTTCCT-3′，下游P6 5′-TCATCAGTCCTCACCTGAGG-3′。引物均由上海细胞所合成。

　　3.仪器：PCR仪为上海复日公司产品，高压电泳仪为LKB公司产品。

　　三、方法

　　(1) 按常规方法抽提组织和外周血白细胞DNA。(2) MTS1基因外显子1的PCR-SSCP分析：外显子1 PCR扩增；外显子1 PCR产物的SSCP分析。(3) MTS1基因外显子2的PCR扩增和DNA序列分析。

结　　果

　　一、MTS1外显子1 PCR-SSCP结果

　　MTS1基因外显子1 PCR扩增发现，18例原发性膀胱癌无一例发生纯合性缺失；外显子1 SSCP分析发现18例原发性膀胱癌PCR产物与正常对照无带型改变。说明18例膀胱癌均无MTS1外显子1基因突变。

　　图1　MTS1基因外显子2 PCR产物电泳结果。

　　m:pUC18/HpaⅡ限制酶DNA片段长度对照，1、

　　3、5为肿瘤组织，2、4、6为正常对照。所得片段与期待片段相符

　　二、MTS1外显子2 PCR及DNA序列分析结果

　　MTS1基因外显子2 PCR扩增产物为509bp，在18例肿瘤中，未发现纯合性缺失(图1)。MTS1外显子2 DNA序列分析发现2例病人膀胱癌组织MTS1外显子2有突变。1例的第164～166位核苷酸中的3个胞嘧啶核苷酸(C)丢失了其中2个，导致移码突变；另1例的第201位核苷酸由鸟嘌呤核苷酸(G)变为胞嘧啶核苷酸(C)，第202位核苷酸则由C→G,核苷酸发生替换。

讨　　论

　　MTS1由3个外显子和2个内含子组成^［1］。p16蛋白由4个钩样重复序列组成，在这4个钩样重复序列中存在许多保守序列，若该保守序列中的氨基酸发生突变，则导致p16活性明显下降或完全丧失^［8］。本研究共分析了MTS1编码序列的97%，外显子2采用PCR和DNA直接测序方法，结果没有发现MTS1纯合性缺失，但发现2例MTS1外显子2点突变。

　　真核细胞的分裂必须经过两个决定性转变：(1)G₁－S期转变，此时DNA合成开始；(2)G₂－M期转变，此时有丝分裂开始。p16与周期素D1竞争性地与周期素依赖性激酶4(CDK4)结合，抑制CDK4的催化活性，从而抑制细胞从G₁进入S期，抑制细胞生长分裂。但当p16基因因缺失或突变或5′CpG岛异常甲基化而失活时，则不能阻止细胞从G₁进入S期，细胞得以无控制增殖最终向肿瘤发展。研究已证明，在多种肿瘤细胞系和原发性肿瘤中存在MTS1高频率突变，其中包括膀胱癌^［3～7］。

　　在多种癌细胞系观察到了MTS1基因的频发纯合缺失^［3,9］。Kamb等^［3］用位于MTS1周围的序列标志位点(STS)进行MTS1纯合缺失检测，发现15个膀胱癌细胞系有5个含有至少一个标志发生纯合性缺失，缺失率为33%。Spruck等^［4］检测了13个膀胱癌细胞系发现5个细胞系有纯合性缺失，缺失率为38%。但在原发性膀胱肿瘤，缺失的检出率大为降低。Spruck用同样方法检测了31例原发性膀胱癌，结果只有6例纯合性缺失，MTS1缺失率为19%^［4］。Sauter等^［10］用FISH（荧光原位杂交）分析方法证实膀胱癌很少发生纯合性缺失。但也有人在原发性膀胱癌没有检测到MTS1的纯合性缺失^［6,7］。本研究用PCR方法对MTS1基因外显子1和外显子2进行扩增，也没有发现MTS1纯合性缺失。MTS1基因在细胞系中检测到的缺失频率明显高于原发性肿瘤，其可能原因：(1)原发性肿瘤的癌组织被癌旁正常组织所污染^［11］。(2)基因的量影响细胞生长，正常细胞MTS1基因含有2个等位基因，细胞培养时可丧失其中1个或2个等位基因，这样细胞在培养基中获得生存优势^［6］。(3)各研究小组所采用的分析方法不同造成技术方面的差异^［11］。我们采集肿瘤标本时，均取自肿块中央的突起部分，谨防正常组织对肿瘤组织的污染，避免假阴性结果出现。据此我们认为，原发性膀胱癌中，MTS1基因的纯合性缺失可能不是该基因失活的主要机制。

　　在以往的研究中，膀胱癌MTS1点突变发生率较低^{［4，6，7］}。本组18例膀胱癌发现2例MTS1基因点突变，突变率与文献报道相符，证实点突变确是原发性膀胱癌MTS1基因的一种失活机制。

　　根据Knudson假说，促成肿瘤发生的肿瘤抑制基因的2个等位基因都要失活，一般是一个等位基因丢失，而另一等位基因发生小的改变如点突变^［12］。研究证明膀胱癌的9p21杂合性丢失(LOH)发生率可高达80%^［13］，但点突变发生率很低。Carns等^［14］检测了15个有LOH的原发性膀胱癌病例，仅发现1例点突变。我们检测到的原发性膀胱癌MTS1点突变率也只有11%(2/18)。MTS1基因LOH发生率高，而突变率低，在原发性肿瘤中是个普遍现象。此现象的可能原因^［11,13］：(1)现在还有一部分MTS1突变尚未检测到，例如有些突变位于编码序列之外；(2)MTS1基因是共显性的肿瘤抑制基因，也就是说，一个等位基因的丧失赋予细胞一个生长优势，可促进肿瘤的发生；(3)位于9p21区域，在MTS1附近可能还有另外的肿瘤抑制基因；(4)MTS1基因5′CpG岛的异常甲基化是该基因的另一失活机制，这在膀胱癌已得到证实^［15］。

　　本组1例发现164～166位的3个C丢失了2个，导致移码突变，使p16丧失抑癌活性。我们发现的另1例突变是201位的G→C,202位的C→G,导致p16蛋白的第61位氨基酸由谷氨酸变为天冬氨酸，第62位氨基酸则由脯胺酸变为丙氨酸。第62位氨基酸正好位于p16蛋白的第2个钩样重复序列的保守序列中^［1］，因此此例突变使p16蛋白活性下降或丧失，从而使p16不能结合和(或)激活CDK4，即不能抑制Rb蛋白磷酸化，使该p16蛋白的抑制细胞生长分裂功能丧失，导致细胞无控制的生长而引起肿瘤形成。

　　研究证明，原发性膀胱癌的发生与MTS1基因的失活有关，MTS1基因点突变是该基因失活的一种机制，进一步研究MTS1基因在膀胱癌发生发展中的作用，对于阐明膀胱癌的发生机制以及将来进行膀胱癌的基因诊断和治疗有着极重要的意义。

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(收稿：1997-10-21　修回：1998-02-24)