Ganciclovir对转导HyTK基因人膀胱癌EJ细胞DNA含量的影响

中华泌尿外科杂志 1999年第1期第20卷 论　　著

作者：谭万龙　梅骅　张国良　郑少斌　陈彤　吴小兵　张薇

单位：谭万龙　张国良　郑少斌　陈彤（510515 广州，第一军医大学南方医院泌尿外科）；梅骅（中山医科大学第一附属医院泌尿外科）；吴小兵（第一军医大学分子生物学研究所）；张薇（第一军医大学中心实验室）

　　关键词： 膀胱肿瘤；癌；基因

　　【摘要】　目的　了解HyTK基因转移联合Ganciclovir(GCV)对人膀胱癌细胞的杀伤作用。　方法　采用570型粘附式细胞激光定量分析筛选仪测定GCV作用下人膀胱癌细胞株EJ细胞、转导HyTK基因的EJ细胞(EJ/TK)DNA含量的变化。　结果　实验组EJ/TK细胞DNA平均荧光值1 592.08±180.70，明显低于对照组2 047.17±228.41(P＜0.001)；而EJ细胞DNA平均荧光值实验组为2 246.06±234.66，对照组为2 232.97±252.08，两组间差异无显著性(P＞0.5)。　结论　GCV作用能明显降低转导HyTK基因EJ细胞(EJ/TK)的DNA含量，提示HyTK基因转移联合GCV对膀胱癌细胞有杀伤作用。

Ganciclovir effect on the DNA content of human

　　bladder carcinoma EJ cells transfected with HyTK gene

TAN Wanlong,MEI Hua,ZHANG Guoliang,et al

　　【Abstract】　Obejective　To elucidate the ganciclovir effect on human bladder carcinoma cells.　Methods　The DNA fluorescence intensity of human bladder carcinoma cell line EJ cells and HyTK gene transduced EJ cells (EJ/TK) was measured by adherent cell analysis and sorting cytometer (ACAS570).In experimental group,EJ/TK cells and EJ cells were cultured respectively and treated with GCV of 100 μmol/L for 48h,while GCV was absent in controls.Cells were stained by propidium iodide (PI).　Results　The average DNA fluorescence value of EJ/TK7 cells was 1 592.08±180.70 and that of EJ cells was 2 246.06±234.66 in the experimental group;while the average DNA fluorescence value of EJ/TK cells was 2 047.17±228.41 and that of EJ cells was 2 232.97±252.08 in controls.There was no significant difference between experimental and control group of EJ cells (P＞0.5);Comparing with the control,thd average DNA fluorescence value of EJ/TK cells after exposure to GCV decreased significantly (P＜0.001).　Conclusions　GCV could obviously reduce the DNA content of HyTK gene transduced EJ cells and suggest HyTK gene transfer in conjunction with GCV have therapeutical effect on human bladder cancer.

　　【Key words】　Bladder neoplasms　　Carcinoma　　Genes

　　为了解HyTK基因转移联合Ganciclovir(GCV)对人膀胱癌细胞的杀伤作用^［1］，采用570型粘附式细胞激光定量分析筛选仪(ACAS570，美国)分别测定了人膀胱癌细胞株EJ细胞及转导HyTK基因的EJ细胞(EJ/TK)DNA在GCV作用下的含量变化^［2，3］ 。报告如下。

　　材料与方法

　　一、细胞培养与分组

　　人膀胱癌EJ细胞、转导HyTK基因人膀胱癌EJ细胞(EJ/TK)分别用含10%灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液，在37℃、5% CO₂孵箱中培养。取5×10⁴ EJ及EJ/TK细胞分别接种于petri培养皿中，各自设实验组及对照组；培养12小时后，对照组细胞换液继续培养，实验组用含100μmol/L GCV培养液培养48小时。

　　二、细胞DNA荧光值测定^［4，5］

　　吸去培养细胞培养液，PBS洗2次，75%酒精固定10分钟，用PBS洗3次，滴入无DNA酶的RNA酶(1mg/ml)静置20分钟，PBS洗3次后再滴入DNA荧光染料碘化丙啶(PI)染色30分钟，PBS再洗3次，然后用ACAS 570观察测定，摄取细胞DNA荧光扫描图；每份标本随机取5～6个视野，约200个细胞，测定细胞内DNA荧光值。

　　三、统计分析

　　由ACAS 570计算机系统绘制各组细胞DNA荧光值扫描直方图，计算各组细胞DNA平均荧光值，采用t检验进行统计分析，绘制组间比较直方图。

　　结　　果

　　实验组EJ细胞DNA荧光密度与对照组相似，两者相比较的扫描直方图型基本重合(图1)；而EJ/TK细胞DNA荧光密度明显低于对照组，两者相比较的扫描直方图型分离(图2)。

　　GCV作用48小时后，EJ/TK细胞DNA平均荧光值为1 592.08±180.70，对照组为2 047.17±228.41，两组差异有显著性(P＜0.001)；EJ细胞DNA平均荧光值实验组为2 246.06±234.66，对照组为2 232.97±252.08，差异无显著性(P＞0.5)。

　　讨　　论

　　ACAS 570粘附式细胞仪是一种运用荧光、激光和电子计算机技术，对细胞内物质的分布变化及细胞筛选等方面进行分析测试的仪器^［2］，可定量测定DNA的含量。细胞DNA直接调控细胞的增殖分化及退变凋亡，细胞DNA含量增减反映了细胞的增殖或退变，因此我们采用ACAS 570测定GCV对转导HyTK基因的人膀胱癌细胞DNA的影响，来反映HyTK基因转移联合GCV对人膀胱肿瘤细胞的杀伤作用。

　　HyTK基因是潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因与HSV1-TK基因的融合基因，可以表达具有hpt与TK两种功能的融合蛋白^［1］。HSV1-TK基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因，该基因的表达产物TK酶能使GCV转变成一磷酸产物GCV-MP，继而在一磷酸鸟苷激酶作用下成为二磷酸化合物GCV-DP、三磷酸化合物GCV-TP。GCV-TP能抑制细胞DNA聚合酶或作为其底物掺入DNA合成链中，使DNA合成中止，导致细胞死亡^［6-8］。TK基因转移联合GCV治疗肿瘤的作用点是抑制肿瘤细胞DNA合成。在本实验中我们观察到：未转导HyTK基因EJ细胞GCV作用组与无GCV作用组两组细胞DNA荧光密度无明显变化，其荧光值差异无显著性，说明GCV对EJ细胞DNA没有影响。而转导HyTK基因的EJ/TK细胞则完全不同，EJ/TK细胞DNA荧光密度在GCV作用下明显降低，其荧光值也明显减少，说明GCV使EJ/TK细胞DNA的合成减少了，GCV抑制了EJ/TK细胞DNA的合成。这与我们用活细胞计数法所测得的结果相吻合^［9］。结果表明：HyTK基因转移联合GCV确实能抑制人膀胱癌细胞DNA合成，对人膀胱癌有杀伤作用。

　　参考文献

　　[1]　Lupton SD,Bruton LL,Kalberg VA,et al.Dominant positive and negative selection using a hygromycin phosphotransferase-thymidine kinase fusion gene.Moll Cell Biol,1991,11∶3374-3378.

　　[2]　罗深秋，鲍永耀，张薇，等.粘附细胞仪测试高温对培养巨细胞DNA荧光强度的影响.第一军医大学学报，1994，14∶46-47.

　　[3]　谭万龙，梅骅，张国良，等.逆转录病毒载体介导的HyTK基因在人膀胱癌细胞株EJ中表达.中华泌尿外科杂志，1997，18∶172-174.

　　[4]　王前，钟世镇，鲍永耀，等.微电流刺激成骨细胞DNA和钙代谢特性研究.中华实验外科杂志，1996，13∶123-124.

　　[5]　Srivastava V,Miller S,Busbee D.Immunofluorescent evaluation of DNA repair synthesis using interactive laser cytometry.Cytometry,1993,14∶144-153.

　　[6]　Tiberghien P.Use of suicide genes in gene therapy.J Leukoc Biol,1994,56∶203-209.

　　[7]　Qian E,Bilbao R,Bruna O,et al.Induction of sensitivity to ganciclovir in human hepatocelluar carcinoma cells by adenovirus-mediated gene transfer of herpes simplex virus thymidine kinase.Hepatology,1995,22∶118-223.

　　[8]　Eastham JA,Chen SH,Sehgall,et al.Prostate cancer gene therapy:herpes simplex virus thymidine kinase gene transduction followed by ganciclovir in mouse and human prostate cancer models.Hum Gene Ther,1996,7∶515-523.

　　[9]　谭万龙，张国良，梅骅，等.HyTK基因转移联合丙氧鸟苷对人膀胱癌细胞株EJ体外杀伤作用.中华泌尿外科杂志，1997，18∶731-734.

(收稿：1998-01-04　修回：1998-09-02)