MRP真核表达载体的构建及其在人膀胱癌中的表达

中华泌尿外科杂志 1999年第10期第20卷 论著摘要

作者：章小平　鲁功成　杨红枚　刘　辉　朱　应　刘德立　齐义鹏

单位：章小平　鲁功成　430022 武汉　同济医科大学附属协和医院泌尿外科；杨红枚　刘辉　朱应　刘德立　齐义鹏　武汉大学生命科学院病毒及分子生物学系

　　多药耐受（MDR）是导致化疗失败的重要原因。研究表明：mdr1/P-gp介导的MDR是膀胱癌MDR的重要机制，但不是唯一机制。新近发现的多药耐受相关蛋白（MRP）基因是介导MDR的一种肯定机制^［1］，我们将MRP基因转入膀胱癌细胞，并初步观察了其介导的MDR及MRP的表达。

　　材料和方法

　　真核表达载体pcDNA3.1(+)/MRP1的构建：含全长MRP1 cDNA的载体PJ3Ω/MRP1由荷兰癌症研究所的Marcel Kool博士赠送。用限制性内切酶Nhe I、Not I完全消化PJ3Ω/MRP1和pcDNA3.1(+)后,将电泳回收的目的片段纯化，在T₄连接酶作用下12℃过夜；将连接产物转化后，挑选阳性转化子，扩增后酶切鉴定。

　　细胞培养及重组子转染：膀胱癌EJ细胞以含7%小牛血清不含抗生素的RPMI1640培养。转染用脂质体方法，操作按产品说明进行。转染48小时后检测。以转染空载体的EJ细胞为对照。

　　细胞药物敏感检测采用改良的MTT法。每次实验至少平行重复3次，求取细胞存活率，以细胞存活率为纵坐标，药物浓度对数为横坐标绘图求取半数抑制浓度(IC₅₀)，并计算每种药物IC₅₀的平均值和标准差以及相对耐受度(RR)。

　　细胞存活率=

　　100％

　　MRP1免疫细胞化学检测采用免疫荧光间接法 。MRP单抗QCRL-1由Cole惠赠^［2］，P-gp单抗JSB-1购自博士得公司。分别以PBS代替QCRL-1和P-gp为对照。

　　结　果

　　构建的重组子中克隆的MRP1基因全长5590bp，由Zaman等^［3］克隆，和Cole等^［1］ 克隆的MRP cDNA在其开放阅读框内有7个碱基变异，但这些改变被证明并不引起MRP结构和功能的明显变化。重组子pcDNA3.1(+)/MRP1构建后，经多种酶酶切后证实。

　　转染MRP1的EJ细胞较对照的EJ细胞对长春新碱、阿霉素、羟基喜树碱的耐受性分别提高11倍、7.4倍、5.6倍，统计学有显著性意义（P＜ 0.01）；对足叶乙甙、甲氨喋呤、噻替哌、丝裂霉素、氟尿嘧啶耐受性分别提高3.3倍、3.2倍、2.7倍、2.2倍和2.1倍；对顺铂、卡铂、环磷酰胺耐受性无明显改变（表1）。

表1　转染的EJ细胞和对照细胞的药物敏感试验结果

　　IC₅₀单位标*者为nmol/L。各值标准差均小于0.05　　转染MRP1的EJ细胞大部分有MRP1荧光染色，主要集中在细胞膜和细胞浆中，而对照细胞只有非特异性的弱荧光染色，实验和对照细胞的P-gp荧光染色均为非特异性的弱荧光染色。对照均为阴性。

　　讨　论

　　MDR的机制很复杂，P-gp高表达是最常见的机制，但有些MDR细胞并不高表达P-gp。Cole等^［1］从没有P-gp表达的H69AR上克隆了MRP基因，该基因定位于16p13.1，开放阅读框编码1531个氨基酸，相对分子质量为190 000。MRP作用机制尚不十分清楚，虽然MRP表型的细胞内药物浓度下降，推测它具有和P-gp相似的外泵药物功能，但未发现MRP和药物结合的直接证据^［4］；另有研究观察到MRP具有改变胞内药物重新分布的功能,从而使药物无法到达作用靶区^［5］。

　　研究表明，MRP和P-gp一样,肯定参与了膀胱癌细胞的MDR。Hasegawa等^［6］的研究提示同一膀胱癌细胞由不同化疗药物体外诱导可产生不同程度的P-gp、MRP表达,而不同膀胱癌细胞由同一药物体外诱导也可出现P-gp、MRP的不同程度表达,表明体外诱导的MDR膀胱癌细胞常常有多种机制同时参与，这就使研究者很难靠体外药物诱导的方法来研究膀胱癌细胞某一单一机制介导的MDR。而转染基因进入靶细胞无疑提供了一种很好的方法。有人将MRP1基因转入Hela细胞和肺癌细胞,发现能使细胞获得典型的MDR^［3，7］。

　　我们将MRP1基因转染EJ细胞后，转染子没有P-gp表达，但有较高的MRP瞬时表达，呈典型的MDR表型。提示MRP高表达可介导膀胱癌细胞产生典型的MDR，至少克服了P-gp介导的MDR的干扰，为研究膀胱癌MRP介导的MDR提供了一种良好模型。

　　本课题受国家自然科学基金项目资助(39670723)

　　参考文献

　　1　Cole SPC, Bhardwaj G, Gerlach JH, et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistance human lung cancer cell line.Science，1992，258∶1650-1654.

　　2　David RH, Kurt CA, Brenda DS, et al. Location of a protease hyper-sensitive region in the multidrug resistance protein(MRP) by mapping of the epitope of MRP-specific monoclonal antibody QCRL-1. Cancer Res，1996，56∶3307-3314.

　　3　Zaman GJR, Flens MJ,Van Leusden MR, et al. The human multidrug resistance-associated protein MRP is a plasma membrane drug-efflux pump.Proc Natl Acad Sci USA，1994,91∶8822-8826.

　　4　Cole SPE, Sparks KE, Fraser K, et al. Pharmacological characterization of human tumor cells. Cancer Res，1994，54∶5902-5910.

　　5　Loe DW, Almquist KC, Deeley RG,et al. Multidrug resistance protein(MRP)-mediated transport of leukotriene C4 and chemotherapeutic agents in membrance vesicles:demonstration of glutathione-dependent vincerstine transport. J Bio Chem，1996，271∶9675-9682.

　　6　Hasgawa S, Abe T, Naito S, et al. Expression of multidrug resistance-associated protein(MRP),MDR/and DNA topoisomerase in human multidrug-resistant bladder cancer cell. Br J Cancer，1995，71∶907-913.

　　7　Almquist KC, Loe DW, Hpfner DR, et al. Characterization of the Mr 190,000 multidrug resistance protein(MRP) in drug-selected and transfected human tumor cells. Cancer Res，1995，55∶102-110.

收稿：1998-11-18

　　修回：1999-05-19