膀胱癌染色体微卫星不稳定性及杂合性丢失
中华泌尿外科杂志 1999年第10期第20卷 论著
作者：黄 毅 陈忠新 谢蜀生 布 卡
单位：黄毅 陈忠新 100083 北京医科大学第三医院泌尿外科；谢蜀生 布卡 北京医科大学免疫学系
关键词： 膀胱肿瘤；癌；微卫星不稳定
摘要 目的 探讨染色体微卫星不稳定性(MSI)及杂合性丢失(LOH)在膀胱癌早期诊断中的意义。 方法 运用位于4、5、9、21号染色体上的四对微卫星标志，结合PCR银染技术，分别检测22例膀胱癌患者肿瘤组织及尿脱落细胞染色体MSI及LOH。 结果 肿瘤及尿液标本MSI的发生率分别为23％、19％，LOH发生率分别为41％、18％，至少有一个 位点出现MSI或LOH分别为59％及32％。不同年龄、性别、临床分期、肿瘤组织分级的患者MSI与LOH的发生率差异均无显著性（P＞0.05)。 结论 检查尿液中肿瘤脱落细胞的MSI及LOH可能成为膀胱癌筛选及监测复发的辅助方法。
Loss of heterozygosity and microsatellite instability in bladder cancer
HUANG Yi，CHEN Zhongxin,XIE Shusheng,et al.
Department of Urology, Third Hospital of Beijing Medical University,Beijing 100083
Abstract Objective To evaluate the loss of heterozygosity (LOH) and microsatellite instability (MSI) in the early diagnosis of bladder cancer. Methods LOH and MSI were studied in the tumor tissue and urine sediment of 22 cases of bladder cancer by means of PCR amplification of 4 polymorphic microsatellites DNA loci on chromosome 4,5,9 and 21. Results 5 tumors (23%) and 4 urine sediments (19%) showed MSI;10 tumors (41%) and 4 urine sediments (18%) showed LOH at one or more loci.Molecular genomic change (MSI or LOH) at one or more loci was observed in 59% of the tumors (13/22) and in 32% of urine sediments (7/22).The frequency of either MSI or LOH was not significantly related to the tumor grade,tumor stage,patients's age or sex (P＞0.05). Conclusions DNA microsatellite analysis of droped tumor cells in urine might be a useful additional method for early diagnosis of bladder cancer.
Key words Bladder neoplasms Carcinoma Microsatellite instability
近年来研究发现，染色体微卫星不稳定性参与了肿瘤的发生发展，可能成为肿瘤发生的一种新机制［1］。因此进一步从分子遗传水平上研究肿瘤的病因机制及与其它因素的关系，将有助于肿瘤的早期诊断、治疗及预防。我们应用PCR银染技术选取位于不同染色体上的4个微卫星标志，检测了22例膀胱癌组织及尿液标本染色体微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI）及杂合性丢失(loss of heterozygosity,LOH)。报告如下。
材料及方法
一、病例选择
22例均为住院患者，男性13例，女性9例。平均年龄66岁。病理证实均为膀胱移行细胞癌，临床分期T1 3例，T2 12例，T3，7例。病理分级Ⅰ级5例，Ⅱ 级13例，Ⅲ级4例。分别收集肿瘤组织，晨尿离心沉淀，并取静脉血作为正常组织DNA对照。
二、DNA的提取
采用常规蛋白酶K消化,酚-氯仿-异戊醇提取，盐沉淀，紫外分光光度计定量后备用。
三、PCR引物及条件
实验选用染色体微卫星位点分别为ACTBP2、D21S1245、D4S243、IFN-A，四对引物序列查自The Genome Database(GDB)，由中科院微生物所合成。扩增条件：25μl反应体系，加入10×PCR缓冲液2.5μl，基因组DNA25ng，上下游引物各10pmol；100μmol/L、4×dNTP，TaqDNA聚合物1U，经95°C预变性5分钟后，94°C 60秒、53°C 60秒、72°C 60秒，35个循环，72°C延伸10分钟。
四、变性凝胶电泳及银染
取5μl PCR产物与等量甲酰胺混匀，95℃ 5分钟，加入2μl、6倍加样缓冲液，上样于8%变性聚丙烯酰胺凝胶，600V、电泳1小时，按文献方法银染［2］。
五、判定标准
将肿瘤组织及尿液标本与其相应的正常组织特定位点的PCR产物同时上样、电泳，比较银染结果。若肿瘤及尿液标本特定位点某一基因条带消失或相对密度减少50％以上，记录为LOH，如图1a。若与正常相比出现等位基因条带的增多及大小的改变则记为MSI，如图1 b,c, d。
图1 PCR-银染显示膀胱癌不同位点的MSI及LOH。
T：肿瘤组织，U：尿液，N：对照
结 果
表1示膀胱癌不同染色体位点的MSI及LOH发生频率，肿瘤及尿液MSI的发生率分别为23％、18％, LOH发生率分别为41％、18％。 肿瘤及尿液标本至少有一个位点出现LOH或MSI，分别为59％及32％。5例标本出现2个位点及以上的遗传改变。IFN-A位点仅出现LOH,且频率较高，D21S1245及D4S243MIN发生率相对较高。不同肿瘤分级、临床分期、性别及年龄MSI与LOH发生频率差异无显著性（χ2检验,P＞0.05），但MSI及LOH阳性组中，肿瘤分级、分期略高于阴性者。
表1 肿瘤组织及尿液在不同染色体位点的MSI及LOH频率(例)
| 位点 |
标本数 |
肿瘤组织 |
尿液 |
| LOH |
MSI |
LOH |
MSI |
| ACTBP2 |
22 |
3 |
1 |
2 |
1 |
| D21S1245 |
22 |
2 |
2 |
1 |
1 |
| D4S243 |
22 |
2 |
2 |
0 |
2 |
| IFN-A |
22 |
5 |
0 |
2 |
0 |
讨 论
微卫星DNA指基因组中由2、3或4个核苷酸为单位组成的简单串联式重复序列，具有高度的遗传多态性。它们广泛分布于人类基因组，尤以双核苷酸重复序列（CA）n最为常见。染色体微卫星产生的机理目前还不完全清楚，一般认为是遗传物质在复制过程中DNA滑动导致错误负性或在有丝分裂及减数分裂期染色体不对等交换所致［3］。微卫星不稳定性是指染色体的复制错误导致重复序列的增加或丢失。近年来MSI与肿瘤的关系受到广泛关注，最初于结、直肠癌中发现MSI，以后相继在肾癌、膀胱癌、前列腺癌等其它肿瘤也发现存在MSI［4,5］。MSI是肿瘤常见的分子遗传改变，可作为肿瘤的克隆标志应用于肿瘤的早期诊断。肿瘤常在抑癌基因位点出现LOH，应用微卫星标志容易检测，通过检测分析肿瘤染色体LOH及其规律，可在染色体一定范围内发现肿瘤的抑癌基因及易感基因［6］。
本实验选用位于第4、5、9、21号染色体的4个微卫星标志，同时检测膀胱癌组织及尿液中肿瘤脱落细胞MSI及LOH，至少有一个微卫星位点出现遗传改变分别占59％和32％，尿液的MSI检出率略低于肿瘤组织，而LOH的检出率明显低于肿瘤组织达13％，可能尿液中混有的白细胞及正常尿路脱落细胞干扰了LOH的检测。研究发现，9号染色体极易出现LOH，有2个抑癌基因分别位于9号染色体的长短臂上，并且肿瘤发生早期即可出现9号染色体等位基因丢失［7］。IFN-A位于9号染色体短臂。本实验IFN-A位点LOH发生率达23％（5/22），未出现MSI，进一步说明9号染色体遗传改变在膀胱肿瘤的发生发展中有重要意义。
目前临床上一般采用B超、膀胱镜、尿脱落细胞学等检测方法对膀胱癌进行诊断，敏感性不理想。因此，建立一种通过尿液能快速、准确、灵敏地检测出早期膀胱癌的方法具有重要的临床价值。PCR-银染法灵敏度高、安全、经济。膀胱癌早期即可出现遗传学方面的改变，应用染色体微卫星标志通过筛选膀胱癌高突变区的染色体多个微卫星位点，结合PCR及细胞分选技术，如免疫磁珠等方法去除干扰细胞，以尿脱落细胞的微卫星不稳定及杂合性丢失为指标，在膀胱癌的早期诊断及复发监测方面具有广阔的应用前景。本课题受卫生部基金资助(96-1-275)
参考文献
1 Orlow I,Lianes P,Lacombe L, et al. Chromosome 9 allelic losses and microsatellite alterations in human bladder tumors. Cancer Res,1994,54∶2848-2851.
2 朱丹，王亮，吴.运用PCR-SSCP银染技术检测食管癌p53基因点突变.中华医学遗传学杂志，1994，11∶354-355.
3 Christian S, Diethard T. Slippage synthesis of simple sequence DNA. Nuclec Acids Res,1992,20∶211-215.
4 Catheine A,Bingham T,Salazar H,et al. Genomic alterations and instabilities in renal cell carcinoma and their relationship to tumor pathology. Cancer Res,1995,55∶6189-6195.
5 Osman I, Scher H, Dalbagni G, et al. Chromosome 16 in primary prostate cancer :microsatellite analysis. Int J Cancer,1997,71∶580-584.
6 Jones MH,Nakamura Y. Deletion mapping of chromosome 3p in female genital tract malignancies using microsatellite polymorphisms.Oncogene,1992,7∶1631-1634.
7 Michel RJ,Tokino K,Sidransky D. Evidence for two bladder cancer suppressor loci on human chromosome 9.Cancer Res, 1993,53∶5093-5095.
收稿：1998-11-19
修回：1999-05-12
用户登录 
新用户注册