极低密度脂蛋白受体基因CGG串联重复序列多态性与冠心病的关系

中国动脉硬化杂志 2000年第2期第8卷 临床研究

作者：邵华　周新　李艳　胡波

单位：邵华　周新　李艳（湖北医科大学　附属第一医院检验科，湖北省武汉市 430060）；胡波（湖北医科大学　中山医科大学附属第三医院检验科， 广东省广州市 510120）

关键词：受体，脂蛋白；脂蛋白，极低密度；基因；多态性；等位基因；冠状动脉疾病；聚合酶链反应

　　［摘　要］　极低密度脂蛋白受体基因5'非编码区起始密码子上游19 bp处存在CGG三核苷酸串联重复序列，为探讨中国汉族人群极低密度脂蛋白受体基因CGG串联重复序列多态性与冠心病的相关性，采用聚合酶链反应、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染等技术分析湖北地区75例冠心病患者和160例正常汉族人CGG串联重复序列。共检出CGG串联重复次数为5、8、9、11的四种等位基因及5/5、5/8、8/8、8/9、9/9、5/9、8/11和5/11等八种基因型，冠心病组和对照组极低密度脂蛋白受体等位基因频率和基因型频率分布无统计学差异（P＞0.05），结果提示，极低密度脂蛋白受体基因CGG串联重复序列多态性与冠心病没有关联。

　　［中图分类号］　R363.25　　　［文献标识码］　A

　　［文章编号］　1007-3949(2000)-02-0169-03

The Correlation between CGG Triplet Repeat Ploymorphism of Very Low Density Lipoprotein Receptor Gene and Coronary Heart Disease

SHAO Hua， ZHOU Xin， LI Yan， and HU Bo

　　(Medical Laboratory Science， the First College of Clinical Medicine， Hubei Medical University， Wuhan 430060， China)

　　ABSTRACT　　 Aim　 To explore the correlation between CGG triplet repeat polymorphism on the 5' non-coding region of very low density lipoprotein receptor (VLDLR) gene and coronary heart disease (CHD) in Chinese Han nationality, 235 subjects with no blood links in Hubei region, including 75 cases with CHD and 160 healthy controls were studied. 　　Methods　 Polymerase chain reaction (PCR)-denature polyacrylamide gel electrophoresis-silver stain technique was employed to determine the CGG triplet repeat polymorphism of VLDLR gene. 　　Results 　 The Chinese Han nationality in Hubei region has VLDLR gene polymorphism, 4 alleles with 5, 8, 9, 11 CGG triplet repeats and 8 genotypes with 5/5, 5/8, 8/8, 8/9, 9/9, 5/9, 8/11 and 5/11 were detected. 　There were no statistically significant differences in VLDLR gene allele and genotype frequencies between CHD and normal controls (P＞0.05). 　　Conclusions 　 There is VLDLR gene polymorphism in the Han Chinese in Hubei region and such polymorphism has ethnic difference.　 CGG triplet repeat polymorphism of VLDLR gene has no correlation with CHD. 　It is not an independent risk factor.

　　MeSHReceptor， LDL；　Genes；　Polymorphisms；　Gene Alleles; 　Coronary Disease; 　Polymerase Chain Reaction

　　极低密度脂蛋白受体（very low density lipoprotein receptor, VLDLR）是低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor, LDLR）基因家族的新成员，其分子在结构上与LDLR关系最近^［1］。人VLDLR基因定位于9p24，含19个外显子，18个内含子，长约40 kb。VLDLR和LDLR基因来自共同的原始基因，结构和组成几乎完全相同。值得注意的是，VLDLR基因5'非编码区（5'-untranslated region，5'-UTR）起始密码子上游19 bp处存在CGG三核苷酸重复序列^［2］。人们推测这一结构可能与某些疾病有关。国外的统计资料表明，该CGG重复序列在正常人群中的分布呈高度多态性，且有民族差异。本文采用常规聚合酶链反应、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染等技术，对湖北地区75例冠心病（coronary heart disease, CHD）患者和160例正常人CGG重复序列进行了分析，旨在探讨中国汉族人群VLDLR基因CGG重复序列多态性与冠心病的相关性。

　　1　材料和方法

　　1．1 　研究对象

　　选取在我院住院的冠心病患者75例，其中男性45例，女性30例，平均年龄65.2±9.5岁。健康体检者160例，其中男性86例，女性74例，平均年龄55.7±14.6岁。两组研究对象的性别、年龄均无显著性差异。冠心病的诊断依据1981年全国冠心病、高血压普查预防座谈会修订标准，排除家族性高胆固醇血症、脂肪肝、糖尿病和甲状腺疾病等影响脂质代谢疾病^［3］。

　　1.2　 聚合酶链反应扩增

　　取EDTA-Na₂抗凝血100　μL，采用改良碘化钠法^［4］提取正常人白细胞基因组DNA。参照文献［5，6］合成一对引物，其序列为P1：5'-GCAGCCAGAGCGCCCAGAGCG-3'（sense）；P2：5'-AGGGCTGGTAACTTGTTGTGCGGAG-3'（antisense）（由加拿大Sangon公司合成）。引物位于CGG重复序列的两侧，扩增片段大小为82 bp+（CGG）n。PCR扩增按常规方法在PE2400热循环仪上进行。反应总体积50 μL，其中包括：0.5 μg模板DNA、引物P1和P2各30 pmol、dNTPs各200 μmol/L、10×buffer 5 μL、2.0 mmol/L MgCl₂及10%二甲基亚砜。95℃预变性5 min后，取出置冰浴中，加Taq DNA聚合酶1.5 u，进行扩增。循环条件为：94℃1 min，65℃1 min，72℃1 min，共循环30次。以灭菌超纯水代替模板DNA作为反应系统的阴性对照。

　　1.3　 聚合酶链反应产物分子量及CGG重复次数的确定

　　聚合酶链反应(PCR)产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，在BIO-RAD手工测序仪上进行。将PCR产物2 μL点样于含7 mol/L尿素的T=6%、C=5%的聚丙烯酰胺凝胶中，1×TBE，10 W恒功率，电泳4 h后进行银染。同时参照两个分子量大小标记（pBR 322 DNA/HaeⅢ Markers和pBR 322 DNA/MspⅠ Markers）确定扩增片段的大小，从而推算出CGG三核苷酸重复序列的重复次数。

　　1.4　 统计学处理

　　等位基因频率采用基因计数法计算；研究对象结果与Hardy-Weinberg平衡符合程度及组间基因型和等位基因频率比较采用χ²检验。

　　2 　 结　果

　　2.1　 基因型频率分布

　　共检出4个等位基因，扩增产物的分子量分别为：97 bp、106 bp、109 bp和115 bp，其CGG重复次数分别相当于5、8、9和11次；检出的8种基因型分别是：5/5、5/8、8/8、8/9、9/9、5/9、8/11及5/11（图1, Figure 1）。

图1.　极低密度脂蛋白受体基因聚合酶链反应产物图谱.

　　Figure 1.　 Patterns of VLDLR gene PCR products.　Lane 1～3、5、6、8～10：correspond to 5/5、8/8、9/9、5/8、5/9、5/11、8/9、8/11； Lane 4：pBR 322 DNA/HaeⅢ Markers； Lane 7： pBR 322 DNA/MspⅠ Markers.

　　从表1（Table 1）可知，对照组VLDLR基因CGG重复序列检出了8种基因型，冠心病组中检出了6种基因型，未发现9/9和8/11基因型。对照组和冠心病组5/8基因型最常见，其次为8/8和5/5，而8/9、9/9、5/9、8/11和5/11均为少见型。两组间各基因型频率分布总体趋势一致，无显著性差异（P＞0.05）。

　表1． 　 冠心病组与对照组极低密度脂蛋白受体基因CGG重复序列基因型频率分布.

　　Table 1．　 Genotype frequencies of CGG triplet repeat in VLDLR gene in CHD and control groups.

　　2.2 　 等位基因频率分布

　　根据VLDLR基因型频率分布结果和VLDLR复序列等位基因共显性的特点，按Hardy-Weinberg平衡定律计算两组VLDLR的4种等位基因频率。从表2（Table2）可以看出，在两组中CGG重复数为8的等位基因出现频率最高，分别是53.3%和48.7%。两组间各等位基因频率分布无统计学差异（P＞0.05）。

表2．　 冠心病组与对照组低密度脂蛋白受体基因CGG重复等位基因频率分布.

　　Table 2．　 Allele frequencies of CGG triplet repeat in VLDLR gene in CHD and control groups.

　　3　 讨　论　　众所周知，冠心病是一类严重危害人类健康的疾病，其病理基础为动脉粥样硬化。一些研究表明，动脉粥样硬化与载脂蛋白E基因多态性的关系十分密切^［7］。而载脂蛋白E是VLDLR的主要配体，VLDLR通过识别载脂蛋白E而摄取含载脂蛋白E的脂蛋白颗粒，两者在生物化学上有密切关联^［2］。因此，有人提出VLDLR与冠心病之间是否也有一定的联系。1994年，Sakai首次报导VLDLR基因5'-UTR起始密码子上游19 bp处存在CGG三核苷酸重复序列后，立即引起各国学者的关注。本文就VLDLR基因CGG三核苷酸重复序列与冠心病的关系作了初步探讨，共检出CGG重复次数为5、8、9、11的四种等位基因及5/5、5/8、8/8、8/9、9/9、5/9、8/11和5/11等八种基因型。与国外已有的文献［8，9］比较，中国人群（湖北地区）VLDLR基因CGG重复序列等位基因频率分布与日本人及中国香港人群基本一致。冠心病组与对照组比较，基因型和等位基因频率分布均无显著性差异，提示VLDLR基因CGG重复序列多态性与冠心病没有关联，这与Helbecque等^［5］的研究结果一致。该CGG重复序列存在于VLDLR的非编码区，它可能与VLDLR基因的编码区连锁不平衡，目前还不能否定VLDLR基因的编码区不是冠心病的危险因子。关于VLDLR基因5'-UTR的CGG三核苷酸重复序列多态性的研究尚处于起步阶段，还有待于在汉族和其它民族中进行大样本的调查研究工作。研究简单重复序列的传统方法主要有DNA指纹图谱法、限制性片段长度多态性分析法、寡核苷酸探针分析法及扩增片段长度多态性分析法等^［10］。本研究采用了PCR、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染技术分析VLDLR基因5'-UTR的CGG重复序列扩增片段长度多态性。该技术简便迅速，操作时间短，分辨率、灵敏度明显高于普通凝胶电泳，结果准确可靠，重复性好，无同位素污染，克服了其它技术方法中存在的缺点。因此，该法适合实验室开展，在遗传病诊断、基因定位和法医学上有着广阔的应用前景。

　　［作者简介］　邵 华，女，1971年7月出生，硕士研究生。

　　参考文献

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1999－09－09收到

　　2000－01－08修回