血浆纤溶酶原激活物抑制因子基因启动子多态性与2型糖尿病伴发冠心病的关系

中华老年医学杂志 1998年第6期第17卷 临床研究

作者：丁国宪　沈捷　陈家伟

单位：210029 南京医科大学第一附属医院老年医学科(丁国宪)，内分泌科(沈捷、陈家伟)

　　关键词： 糖尿病，非胰岛素依赖型；冠状动脉疾病；纤溶酶原灭活剂

　　摘要　目的　从分子遗传水平进行基因多态性研究，以探讨2型糖尿病易伴发冠心病的内在原因。　　方法　对81例2型糖尿病患者、93例非糖尿病(非DM)患者进行口服糖耐量试验、血脂分析、血浆纤溶酶原激活物抑制因子(PAI-1)基因多态性分析。　　结果　2型糖尿病和非DM相比PAI-1基因启动子4G频率明显增加(42% 和 31%，P＜0.001)；2型糖尿病伴冠心病与不伴冠心病相比，PAI-1基因启动子4G频率及4G/4G基因型频率存在明显差异(52% 和 30%,32% 和 14%;P分别＜0.001、0.05)；非2型糖尿病伴冠心病与不伴冠心病相比，PAI-1基因启动子4G频率及4G/4G基因型频率则无明显差异(31% 和 31%,8% 和 16%,均为P＞0.05)。　　结论　PAI-1基因4G等位基因可能是糖尿病合并冠心病的内在危险因素。

The relationship between polymorphism of PAI-1 gene and type 2 diabetes mellitus associated with coronary heart disease

Ding Guoxian, Shen Jie, Chen Jiawei. First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029

　　Abstract　Objective　To explore the association of type 2 diabetes with coronary heart disease (CHD), from gene polymorphism analysis. 　　Methods　The polymorphism of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) gene was analyzed by PCR technique in 81 elderly with type 2 diabetes and 93 non-diabetic elderly.　　Results　The frequency of PAI-1 4G in type 2 diabetics was significantly increased than in non-diabetics (42% vs 31%, P＜0.001). The frequency of 4G/4G genotype and 4G allele frequency of PAI-1 gene were increased in type 2 diabetic patients with CHD in comparison with type 2 diabetes without CHD (32% vs 14%, 52% vs 30%, P＜0.05，0.001，respectively). Between the non-diabetics with CHD and without CHD there was no significant difference (8% vs 16%,31% vs 31%,P＞0.05).　　Conclusions　These results suggest that the 4G allele of PAI-1 gene might be an intrinsic risk factor of type 2 diabetes with CHD.

　　Key Words　Diabetes mellitus, non-insulin-dependent Coronary disease Plasminogen inactivators

　　文献报道，2型糖尿病(NIDDM)患者血浆纤溶酶原激活物抑制因子(PAI-1)活性明显升高，而1型糖尿病患者PAI-1活性则未见变化^〔1～3〕。

　　有报道，近来国外发现在人类PAI-1基因转录起始点上游675处由于单个的鸟嘌呤(G)插入或缺失，形成了4个鸟嘌呤碱基序列(GGGG)或5个鸟嘌呤碱基序列(GGGGG)的多态性改变，即4G等位基因和5G等位基因，可有4G/4G、5G/5G、4G/5G 3种基因型；PAI-1基因启动子多态性和血浆PAI-1活性相关^〔4〕。因此，我们对中国老年人群进行PAI-1基因启动子多态性研究，探讨这些基因变异和2型糖尿病、冠心病间的关系。

对象和方法

　　一、对象

　　1994年10月～1997年3月门诊及住院老年患者174例，年龄60～80岁，平均67岁。通过体检、肝功能、肾功能等检查排除继发性高血压、肾脏并发症。所有病例通过糖耐量试验(OGTT)分为两组：(1)非糖尿病组(非DM组)：93例，男70例，女23例；其中冠心病(CHD)23例，高血压23例，CHD合并高血压26例，无CHD及高血压21例。(2)2型糖尿病组(NIDDM)：81例，男60例，女21例；其中CHD15例，高血压25例，CHD合并高血压29例，无CHD及高血压12例。糖尿病诊断根据1985年WHO标准^〔5〕，CHD诊断根据1979年WHO标准^〔6〕。

　　二、方法

　　1.OGTT：所有病例均隔夜空腹，次晨口服75g葡萄糖，按空腹(0′)、服糖后30分钟(30′)、60分钟(60′)、120分钟(120′)、180分钟(180′)五点取血样分别做血糖(G)、胰岛素(Ins)、C肽测定，并计算血糖曲线下面积(AUC)及胰岛素曲线下面积(Ins AUC)。

　　2.血脂测定：新鲜标本分离血清后，用酯酶法测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)。

　　3.血压测量：采取标准袖带汞柱式血压计，测血压前休息半小时，取坐位，右上肢测血压，以Korotkoff第Ⅴ期作为舒张压、每次间隔2～5分钟，共测3次，取其均值。

　　4.基因突变检测：(1)DNA抽提：采外周血5ml(肝素抗凝)，用高渗盐法提取周围血白细胞基因组DNA。(2)PAI-1基因启动子多态性分析：合成PCR扩增引物：插入型等位基因(5G)引物：5’-GTCTGGACACGTGGGGG-3’；缺失型等位基因(4G)引物：5’-GTCTGGACACGTGGGGA-3’；共同的下游引物：5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTCTAG-3’；上游对照引物：5’-AAGCTTTTACCATGGTAACCCCTGGT-3’。(3)检测原理：为了检测PAI-1启动子基因型中的4G及5G等位基因，设计了4G、5G两种特异的等位基因引物，分别用于检测4G、5G等位基因，所以每次PCR仅能测定1种等位基因(电泳后是否存在条带)，每一标本都分别进行2次PCR扩增才能判断出基因型4G/4G、5G/5G、4G/5G。(4)PCR扩增：取基因组DNA 0.5μg，引物各0.1μmol/L，2mmol/L MgCl₂，50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl(pH8.4)，0.2mmol/L dNTP，1U Taq酶，使总体积达25μl，在PCR合成仪上合成DNA片段。首先94℃预变性5分钟，接着进入以下循环：94℃变性1分钟,67℃退火1分钟,72℃延伸2分钟，共30个循环，最后72℃再延伸5分钟。(5)电泳：2%琼脂糖凝胶上电泳，电压110V，时间1～2小时，在紫外分光下观察结果。

　　三、统计学处理

　　计算各组的基因型频率，由基因型频率计算各组等位基因频率，计数资料比较采用χ²检验，两组间计量资料，均数比较采用t检验。

结　　果

　　一、PAI-1基因启动子扩增片段电泳结果

　　结果见附图，等位基因测定以DNA标准物为参照，根据电泳图上是否出现其条带来判断。经计算，所检测各组病例基因型分布符合Hardy-Weinbery平衡。0为DNA标准物，条带1、2未见5G条带，3、4见5G条带，条带1′、2′、3′见4G条带，4′未见4G条带。标本1、2基因型为4G/4G，3为4G/5G，4为5G/5G

附图　PAI-1基因启动子扩增片段电泳图(2%琼脂糖)

表1　两组体重指数、腰臀比、血压及血脂测定结果(±s)

　　注：1kPa=7.5mmHg;　　NIDDM与非DM比较、CHD与非CHD比较，^*P＜0.05，其余P＞0.05　　二、NIDDM组和非DM组各指标测定

　　结果见表1，NIDDM组与非DM组体重指数(BMI)、腰臀比(WHR)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、TC、HDL、LDL差异无显著性，NIDDM组TG明显增高(P＜0.05)。在非DM组中，CHD组与非CHD组BMI、WHR、SBP、DBP、TC、TG、HDL、LDL差异均无显著性。NIDDM组中，CHD组与非CHD组，除BMI明显增高(P＜0.05)外，其他各指标差异也无显著性。

　　三、NIDDM和非DM组PAI-1基因测定

　　结果见表2。两组PAI-1基因型频率差异无显著性，4G等位基因频率差异有显著性(P＜0.001)。在非DM组中，CHD组与非CHD组PAI-1基因型频率及4G基因频率差异均无显著性；在NIDDM组中，二者差异均有显著性(P分别＜0.05及0.001)。

表2　各组间PAI-1基因型分布及基因频率

　　注：(　)内数字为同组百分构成比(%)；NIDDM与非DM比较、同组CHD与非CHD比较，^*P＜0.05，^**P＜0.001

讨　　论

　　PAI-1是血浆纤溶系统的主要抑制物，它可与纤溶系统的主要激活物组织纤溶酶原激活剂(t-PA)和尿激酶结合，抑制两者的活性，导致纤溶活性的降低，造成冠状动脉血栓形成的危险性增高，溶栓疗效差，使2型糖尿病并发心肌梗死患者病死率明显高于非糖尿病患者^〔1，7〕。目前有学者认为血浆PAI-1水平和胰岛素抵抗综合征中的病变相对应，高PAI-1血症也是胰岛素抵抗综合征的一个显著特征^〔7〕。

　　人PAI-1基因启动子是个强启动子，该区域可能含有对激动剂应答的元件，决定细胞特异性表达的PAI-1的调控元件也在此区域^〔7〕。国外学者研究发现欧洲白种人PAI-1基因启动子多态性与胰岛素水平、甘油三酯、体重指数相关，并与2型糖尿病患者的冠心病发病有关^{〔4，8，9〕}。本资料显示2型糖尿病患者PAI-1基因启动子4G频率较非糖尿病患者明显增加；还显示在非糖尿病组，冠心病患者与非冠心病患者PAI-1基因启动子4G频率及4G/4G基因型频率均无明显变化；而在2型糖尿病组，冠心病患者较非冠心病患者PAI-1基因启动子4G频率及4G/4G基因型频率均明显增加。因而PAI-1基因变异可能仅是2型糖尿病患者易伴发冠心病的内在危险因素。

参　考　文　献

　　1　Mansfield MW,Stickland MH, Grant PJ. PAI-1 concentrations in first-degree relatives of patients with non-insulin-dependent diabetes:metabolic and genetic associations. Thromb Haemost, 1997,77:357-361.

　　2　彭荔薰，冯波.NIDDM患者血浆组织型纤维蛋白溶酶原激活物及其抑制物活性水平与胰岛素抵抗的探讨.中华内分泌代谢杂志，1995，11(2)：117-118.

　　3　Juhan VI, Alessi MC, Vague P. Increased plasma plasminogen activator inhibitor 1 levels, a possible link between insulin resistance and atherothrombosis. Diabetologia, 1991,34:457-460.

　　4　Ye S, Green FR, Scarabin PY, et al. The 4G/5G genetic polymorphism in the promoter of the plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) gene is associated with differences in plasma PAI-1 activity but not with risk of myocardial infarction in the ECTIM study. Thromb Haemost, 1995,74:837-841.

　　5　Report of WHO study group. Diabetes mellitus. Tech Rep Ser, 1985,727:1-113.

　　6　Report of the Joint International Society and Federation of Cardiology World Health Organization task force on standardization of clinical nomenclature. Nomenclature and criteria for diagnosis of ischemic heart disease. Circulation, 1979,59:607-609.

　　7　楚英杰.代谢性心血管疾病综合征.国外医学心血管疾病分册，1995，22(6)：333-336.

　　8　Mansfield MW, Stickland MH, Grant PJ. Environmental and genetic factors in relation to elevated circulating levels of plasminogen activator inhibitor-1 in Caucasian patients with non-insulin-dependent diabetes mellitus. Thromb Haemost, 1995,74:842-847.

　　9　Mansfield MW, Stickland MH, Grant PJ. Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) promotor polymorphism and coronary artery disease in non-insulin-dependent diabetes. Thromb Haemost, 1995,74:1032-1034.

(收稿：1997-08-27　　修回：1998-07-27)