小肠脂酸结合蛋白基因多态性与2型糖尿病合并冠心病的关系

中华内分泌代谢杂志 1999年第5期第15卷 论著

作者：黄敏　杨香玖　李丽　胡正国　王中丽

单位：430071 湖北医科大学附属第二医院内分泌科

　　关键词： 小肠脂酸结合蛋白；基因；限制性片段长度多态性；糖尿病，2型；冠心病

　　【摘要】　目的　为了解小肠脂酸结合蛋白基因(FABP2)多态性与2型糖尿病合并冠心病(CHD)的关系。方法　2型糖尿病无冠心病组(DM-1)64例，2型糖尿病合并冠心病组(DM-2)82例，非糖尿病冠心病组62例，正常对照组60例。应用聚合酶链反应(PCR)技术检测268例对象FABP2 Hha I位点的限制性片段长度多态性(RFLPs)。结果　(1)武汉地区汉族人存在PABP2 Hha I多态性位点，可产生Thr54(-)和Thr54(+)多态片段。(2)2型糖尿病合并冠心病患者FABP2 Thr54(+)基因型频率显著高于正常人(P＜0.05)。(3)FABP2 Thr54(+)基因类型对2型糖尿病合并冠心病的参与风险率为25.6%，比数比为2.13(95% 可信限是1.05～4.45)。(4)2型糖尿病合并冠心病组含FABP2 Thr54(+)基因类型患者与含FABP2 Thr54(-)基因类型患者比较，空腹胰岛素水平显著增高(P＜0.01)，胰岛素敏感指数显著下降(P＜0.05)。(5)2型糖尿病合并冠心病组含FABP2 Thr54(+)基因类型患者的血甘油三酯水平显著高于含FABP2 Thr54(-)基因类型患者(P＜0.05)，而高密度脂蛋白胆固醇水平显著低于含FABP2 Thr54(-)基因类型患者(P＜0.05)。结论　(1)武汉地区汉族人存在FABP2多态性。(2)FABP2多态性可能与2型糖尿病合并冠心病有一定关联。(3)FABP2多态性可能与2型糖尿病合并冠心病的胰岛素抵抗相关。(4)FABP2多态性可能是2型糖尿病合并冠心病脂质代谢异常的影响因素之一。

Relationship between polymorphism of the human intestinal fatty acid binding protein gene and type 2 diabetic patients with coronary heart disease

HUANG Min,YANG Xiangjiu,LI Li,et al

　　Department of Endocrinology,The Second Affiliated Hospital of Hubei Medical University,Wuhan,430071

　　【Abstract】　Objective　To study the relationship between the human intestinal fatty acid binding protein gene (FABP2) and type 2 diabetic patients with coronary heart disease.Methods　The polymorphism of 54th codon of FABP2 was determined with the PCR and RFLP methods in 268 subjects, inclnding 82 cases of type 2 diabetes with coronary heart disease (CHD), 64?cases of type 2 diabetes without CHD, 62 cases of non-diabetic CHD and 60 normal controls.Results　The polymorphic restri?tion site has been reported in the FABP2 identified by the enzyme Hha I in Han nationality in Wuhan. The frequency of genot?pe Thr54(+) significantly i?creased in the type 2 diabetic patients with coronary heart disease as compared with that in healthy subjects (P＜0.05). There was no significant difference in the frequencies among coronary heart disease, type 2 diabetes, type 2 diabetic patients with coronary heart disease and the control groups, either in genotypes or in alleles. The attributable risk of FABP2 Thr54(+) genotype for the type 2 diabetic patients with coronary heart disease was 25.6%, and odds ratio was 2.13 (95% confidence interval is 1.05～4.45). The patients of Thr54(+) genotype with coronary heart disease had significantly higher fasting insulin level and plasma triglyceride value than those of Thr54(-) genotype patients with coronary heart disease (P＜0.01,P＜0.05). The patients of Thr54(+) genotype had significantly lower insulin sensitive index and lower high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) than those of Thr54(-) genotypeРin type 2 diabetic patients with coronary heart disease (P＜0.05).Conclusions　FABP2 gene polymorphism seems to be associated with the type 2 diabetic patients with coronary heart disease and their insulin resistance. FABP2 gene polymorphism also may be involved in the determination of lipoprotein profiles in the type 2 diabetic patients with coronary heart disease.

　　【Key words】　Intestinal fatty acid binding protein　Gene　Restriction fragment length polymorphism　Diabetes mellitus, type 2　Coronary heart disease

(Chin J Endocrinol Metab,1999,15:290-293)

　　临床流行病学调查表明：糖尿病冠心病发病率是非糖尿病人群3～4倍。2型糖尿病合并冠心病患者存在明显的脂质代谢异常。

　　也有一些学者提出胰岛素抵抗是糖尿病冠心病脂质代谢异常的原发因素^〔1〕。为进一步从分子水平探讨2型糖尿病合并冠心病的可能发病机制，我们就FABP2 54位密码子变异与2型糖尿病并冠心病的关系进行研究探讨。

　　 对象和方法

　　一、对象

　　1.正常对照组(Control)：60人(男29，女31)，年龄(54±6)岁，无肝、肾、甲状腺疾病、无糖尿病和冠心病。

　　2.非糖尿病冠心病组(CHD)：62例(男34，女28)，年龄(53±8)岁，冠心病诊断按1979年WHO缺血性心脏病诊断标准。

　　3.2型糖尿病组：146例(男70，女76)，年龄(58±10)岁，其中2型糖尿病无冠心病组(DM-1)64例，2型糖尿病并冠心病组(DM-2)82例。糖尿病诊断按1985年WHO诊断标准。

　　所有受检对象均是武汉地区汉族人，受检者之间无血缘关系。

　　二、方法

　　1.采用酚-氯仿法提取外周血基因组DNA。

　　2.PCR引物引自文献如下^〔2〕：5'-ACAGGTGTTAATATAGTGAAAAG-3',3'-CTGCCCTTGAC-TTGAGTCCCAT-5'，DNA扩增体系：在反应液中依次加入10×反应缓冲液(复华公司)5　　μl，4种脱氧三磷酸核苷酸5　　μl(各2　　mmol/L)(华美公司)，每种引物50　　pmol/L，基因组DNA 0.5　　μg，去离子水补充反应体系至50　　μl。初次反应于95℃水浴变性10分钟，加Taq DNA聚合酶(复华公司)2U，加入50　　μl石蜡油，进入扩增，93℃变性55秒，59℃退火60秒，72℃延伸55秒，共35个循环，最后1次循环72℃延伸5分钟，然后用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

　　3.限制性内切酶消化：将扩增产物提纯后，加入限制性内切酶Hha I(Promega公司)10U，37℃消化4小时。以8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色、摄片。

　　4.血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、Apo A₁、Apo B、Lp(a)测定均在CL-7200全自动生化分析仪上进行。胰岛素测定采用放射免疫法。

　　5.胰岛素敏感指数(ISI)=-ln(FBG×FIns)。式中FBG为空腹血糖，单位mmol/L；FIns为空腹胰岛素，单位mU/L^〔3〕。

　　三、统计方法

　　1.本文资料所检测群体的小肠脂酸结合蛋白基因(FABP2) Hha I基因型频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。

　　2.因中国人Thr54/Thr54纯合子少，将FABP2基因型分为Thr54(+)与Thr54(-)两类。

　　3.疾病的基因型风险率以参与风险率和比数比表示。比数比(OR)值可估计危险因子与疾病的联系程度，这种联系的稳定性可用显著性检验的P值和可信限来估计，如果可信限包括无效值(OR=1)说明该联系无显著性。

　　4.等位基因检出率采用直接计数法，两组间计量资料比较用t检验，多组比较用方差分析，计数资料比较用χ²检验。以上处理采用医学SAS软件系统进行。

　　 结　果

　　一、武汉地区汉族人FABP2多态性

　　本文研究证实54位密码子未发生变异FABP2〔Thr54(-)〕存在Hha I酶切位点，PCR产物酶解后电泳有99bp和81bp两个片段。54位密码子发生变异的FABP2〔Thr54(+)〕无Hha I酶切位点，PCR产物酶解后电泳只有180bp一个片段(图1)。

图1　FABP2基因的RFLP结果

　　Fig 1　Result of FABP2 gene detected by RFLP

　　二、FABP2多态性与冠心病、2型糖尿病、2型糖尿病合并冠心病的关系

　　本文资料显示：2型糖尿病合并冠心病组FABP2 Thr54(+)基因类型频率显著高于正常对照组(P＜0.05)(表1)。

表1　不同受检组FABP2变异的分布频率表

　　Tab 1　Frequency of FABP2 gene variation in four groups

　　注：表内为频率(个体数)　Data in table are frequency (case)　　三、FABP2与2型糖尿病合并冠心病相关的基因型风险率

　　以2型糖尿病合并冠心病组(DM-2组)的FABP2基因类型计算：FABP2 Thr54(+)基因类型对2型糖尿病合并冠心病的参与风险率为25.6%，其比数比(OR)=2.13，说明FABP2 Thr54(+)基因类型与2型糖尿病合并冠心病有关联。因OR值95%可信限是1.05～4.45，表明OR值有显著性，也就是说FABP2 Thr54(+)基因类型与2型糖尿病合并冠心病的联系有统计学意义。

　　四、FABP2多态性与2型糖尿病合并冠心病临床特征的关系

　　分析FABP2不同基因类型与2型糖尿病合并冠心病一般临床特征的关系，发现年龄、性别、病程、体重指数、吸烟、血压等在FABP2不同基因类型组之间无明显差异(P＞0.05)，表明这些冠心病危险因素与FABP2多态性无直接相关(表2)。

表2　各受检组含FABP2不同基因类型个体临床检测值的比较

　　Tab 2　Comparison of clinical parameters of subjects with different FABP2 genotype in four groups

　　注：与同组Thr54(-)比较　Compared with Thr54(-) in the some group,^*P＜0.05，^**P＜0.01　　五、FABP2多态性与2型糖尿病合并冠心病胰岛素敏感性的关系

　　本资料表明2型糖尿病合并冠心病组含FABP2 Thr54(+)患者与含FABP2 hr54(-)患者比较：空腹胰岛素(FIns)水平显著升高(P＜0.01)，胰岛素敏感指数(ISI)显著降低(P＜0.05，而其余各组含FABP2不同基因类型个体比较，各值无显著性差异(P＞0.05)(表2)。

　　六、FABP2多态性与2型糖尿病合并冠心病脂质代谢的关系

　　分析2型糖尿病合并冠心病患者FABP2不同基因类型与血脂、脂蛋白的关系，发现含FABP2 Thr54(+)基因类型患者甘油渉酯(TG)水平显著高于含FABP2 Thr54(-)基因类型患者(P＜0.05)，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平显著低于含FABP2 Thr54(-)基因类型患者(P＜0.05)(表2)。

　　讨　论

　　小肠脂酸结合蛋白^〔4〕是细胞内脂质结合蛋白家族中的成员之一，它参与细胞内长链脂肪酸的吸收、细胞内代谢和(或)转运，其立体结构是1个低蛋白，且为1种载脂蛋白^〔4〕，包含10股反向平行的β链(β_A，β_B…β_J)，这些β链排列成两个近似相互垂直的片层结构——β_A～β_F形成一个片层，而β_F～β_J形成另一片层，两个β片层合起似蛤壳状外形，称之为β钳夹。这种蛋白结构的关系部位是β钳夹转角处54位和55位的氨基酸，若FABP2基因发生变异，致转角处氨基酸出现任何细微变化(例如Ala54Thr)，都能影响I-FABP的结构、特性，从而影响它对长链脂肪酸的亲和力。

　　关于FABP2基因变异与疾病的关系，Baier等^〔2〕研究Pima印第安人群发现FABP2 54位密码子变异与胰岛素抵抗相关。但也有一些研究结果持不同观点^〔5〕，这种分歧可能是FABP2的限制性片段长度多态性(RFLP)具有种族差异所致。至于FABP2多态性与2型糖尿病慢性合并发症之间的关系，目前尚无结论性意见。

　　?　本研究结果显示2型糖尿病合并冠心病组含FABP2 Thr54(+)基因类型患者空腹胰岛素水平显著高于含FABP Thr54(-)基因类型患者，而胰岛素敏感指数显著低于含FABP2 Thr54(-)基因类型患者。说明2型糖尿病合并冠心病中FABP2 Thr54(+)基因类型患者胰岛素敏感性降低，存在胰岛素抵抗^〔1〕。Baier等^〔2〕认为FABP2基因多态性与胰岛素抵抗相关联的原因是：当FABP2 54位密码子发生变异后，I-FABP对长链脂肪酸的亲和力增加，使肠道吸收食物中更崚的长链脂肪酸，提高了外周组织脂肪氧化率，使游离脂肪酸(FFA)浓度增高。高浓度FFA可抑制肝脏和骨胳肌对胰岛素的敏感性^〔6〕，进而出现胰岛素抵抗。

　　分析2型糖尿病FABP2不同基因类型与脂质代谢指标和冠心病的关系；发现2型糖尿病合并冠心病组含FABP2 Thr54(+)基因类型患者甘油三酯(TG)水平显著高于含FABP2 Thr54(-)基因类型患者，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平显著低于含FABP2 Thr54(-)基因类型患者。表明FABP2 Hha I位点参与调控脂质代谢。研究发现2型糖尿病并冠心病患者FABP2 Thr54(+)频率显著高于正常人，且FABP2 Thr54(+)基因类型对2型糖尿病并冠心病的参　与风险率　为25.6%，比数比为2.13(95%可信限是1.05～4.45)，均表明FABP2 Hha I位点多态性与2型糖尿病合并冠心病相关联。其可能原因是：FABP2 Hha I位点多态性与胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱相关联，而后两者亦是2型糖尿病、冠心病的重要影响因素^〔1〕。

　　本研究表明FABP2基因多态性与2型糖尿病合并冠心病相关联，与2型糖尿病合并冠心病的胰岛素抵抗和脂质代谢异常相关联。这对从分子水平进一步采取措施防治糖尿病血管并发症的发生，无疑是有其一定意义的。

　　参考文献

　　1　Pinget M, Gagliardiono JJ. Insulin resistance and its link to other syndrome. IDF Bulletin, 1991,36:6-10.

　　2　Baier LJ, Scchettini JC, Knowler WC, et al. An amino acid substitution in the human intestinal fatty acid-binding roteins is associated with increased fatty acid binding, increased fat oxidation and insulin resistance. J Clin Invest, 1995,95:1281-1285.

　　3　李光伟， 潘孝仁， Stephen L, 等. 检测人群胰岛素敏感性的一项新指数. 中华内科杂志， 1993，32：656-657.

　　4　Sacchettini JC, Gordon JI. Rat intestinal fatty acid binding protein. J Biol Chem, 1993,268:18399-18404.

　　5　Rissanen J, Pihlajamaki J, Heikkinen S, et al. The Ala 54Thr polymorphism of the fatty acid binding protein 2 gene does not influence insulin sensitivity in Finnish nondiabetic and NIDDM subject. Diabetes, 1997,46:711-713.

　　6　Borden G. Role of fatty acids in the pathogenesis of insuin resistance and NIDDM. Diabetes, 1997,46:3-6.

收稿：1998-05-06　修回：1999-04-08