自主性功能性甲状腺腺瘤TSH受体基因突变研究

中华内分泌代谢杂志 2000年第3期第16卷 论著

作者：李雪萍　施秉银　薛明战　王毅　戴雅丽　何岚　马秀萍　高慧　袁育康　徐莉

单位：李雪萍（陕西医学高等专科学校内科教研室，710068）；施秉银（710061 西安医科大学第一附属医院内分泌科）；薛明战（710061 西安医科大学第一附属医院内分泌科）；王毅（710061 西安医科大学第一附属医院内分泌科）；戴雅丽（710061 西安医科大学第一附属医院内分泌科）

　　关键词： 受体，促甲状腺激素；自主性功能性甲状腺腺瘤；基因突变

　　【摘要】　目的　研究TSH受体(TSHR)基因突变在自主性功能性甲状腺腺瘤(AFTA)发病中的作用。方法　以14例AFTA作为研究对象，另4例为毒性多结节性甲状腺肿、7例扫描呈“冷结节”的甲状腺腺瘤及AFTA周围正常甲状腺组织作为对照，酚-氯仿-异戊醇法提取基因组DNA，对目的基因片段进行聚合酶链反应—单链构象多态性(PCR-SSCP)分析及DNA序列分析。结果　在14例自主性功能性甲状腺瘤标本中，SSCP检测出6例条带变异的个体(43%)，对其中3例进行DNA序列测定，发现1例为620位密码子的点突变，苏氨酸被脯氨酸置换(T620P，ACC→CCC)。2例为单碱基插入突变，在1972与1973位核苷酸之间插入了一个腺嘌呤核苷酸(A)，使得密码子624位以后的氨基酸发生了移码突变。在对照组未发现TSHR基因突变。结论　TSHR基因突变可能在自主性功能性甲状腺腺瘤的发病中起重要作用。

Study on the TSH receptor gene mutations of autonomously functioning thyroid adenoma

LI Xueping,SHI Bingyin,XUE Mingzhan

　　（Department of Endocrinology,First Affiliated Hospital,Xi'an Medical University,Xi'an 710061）

　　【Abstract】　Objective　To obtain more information concerning the thyrotropin receptor (TSHR) gene mutations in the pathogenesis of autonomously functioning thyroid adenomas (AFTAs). Methods　14 diagnosed AFTAs were analyzed, with 4 toxic multinodular goiters, 7 thyroid adenomas (cold nodule on scintiscan) and normal thyroid specimens adjacent to the tumours as controls. The genomic DNA was extracted with phenol-chlormethyl-isoamyl alcohol extraction and ethanol precipitation. The 155 base pairs DNA fragments which encompasses the third cytoplasmic loop and the sixth transmembrane segments in the TSHR exon 10 were amplified by PCR and analyzed by the single-strand conformation polymorphism (SSCP). Direct sequencing of the PCR products was performed with ABI Prism Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit. Results　In SSCP analysis, 6 autonomously functioning adenomas of 14 patients displayed migration abnormally (43%). In sequence analysis of 3 abnormal migrated samples, one substitution at nucleotide 1957 (A to C), and two same insertion mutations of one adenosine nucleotide (A) insertion between nucleotide 1972 and 1973 were identified. No mutations were found in controls. Conclusion　Both one-point substitution mutation and one-base insertion mutation of the TSHR gene may be responsible for the pathogenesis of the autonomously functioning thyroid adenomas.

　　【Key words】　Receptor, thyrotropin; Autonomously functioning thyroid adenoma; Gene mutation

　　自主性功能性甲状腺腺瘤(AFTA)是甲状腺良性腺瘤的一种，多见于中老年人群，以同位素甲状腺扫描呈“热结节”、伴有或不伴有甲状腺激素增高及临床甲亢症状为其特征。本病病因尚不清楚。促甲状腺激素受体(TSHR)—腺苷酸环化酶—cAMP系统对　甲状腺　细胞的增殖分化、激　素合成　起重要作用，AFTA的瘤组织该系统活性很高，且对TSH的刺激无反应。近年来国外报道TSHR基因突变后使该受体-cAMP第二信使系统处于持续激活状态，可能是AFTA发病的原因^〔1-9〕。本研究对中国人AFTA患者的TSHR基因片段进行了分析，以探讨TSHR基因突变在我国AFTA发病中的作用。

对象和方法

　　一、对象

　　选择AFTA患者14例的腺瘤组织及AFTA的周围正常甲状腺组织，另4例为毒性多结节性甲状腺肿(TMG)、7例扫描呈“冷结节”的甲状腺腺瘤作为对照。AFTA病例选择标准：(1)有心动过速，消瘦，乏力和腹泻等甲亢症状；(2)放射性碘吸收率正常或稍高，T₃抑制试验示¹³¹I摄取率不受外源性T₃抑制，TRH刺激试验不能被兴奋；(3)T₃升高，或T₃、T₄同时升高；(4)¹³¹I或^99mTc同位素扫描有特征性改变：腺瘤部位呈“热结节”，周围甲状腺组织和健侧甲状腺腺叶显示很淡或不显示；(5)术后病理证实为甲状腺腺瘤。

　　二、标本采集

　　1.石蜡包埋组织标本：取自1992～1998年本院病理科石蜡包埋组织，包括11例AFTA及3例TMG，7例呈“冷结节”的甲状腺腺瘤。切片后经HE染色，在光学显微镜下区分甲状腺腺瘤和正常甲状腺组织，再分别切片备用。

　　2.外科手术标本：取自1997～1998年本院外科手术，3例AFTA，1例TMG。分别在手术过程中切取肿瘤组织及正常甲状腺组织，漂净血液，消毒滤纸吸干，液氮中冻存备用。

　　三、方法

　　1.石蜡包埋组织DNA的提取：标本加入STE液，加热至80℃脱蜡，500 μg/ml蛋白酶K消化过夜，采用常规酚-氯仿-异戊醇提取基因组DNA。

　　2.新鲜组织DNA的提取：400 μg/ml蛋白酶K消化3～6小时后，采用常规酚-氯仿-异戊醇提取基因组DNA。

　　3.引物选择：设计外引物S和内引物P，进行巢式PCR，扩增片段包括第6穿膜片段第3胞内袢。引物S序列来自文献，引物P为自行设计，其序列分别如下：外显子10，扩增片段长为535bp：S1 5'-TATTGTTTTTGTTCTGACGCT-3',S2 5'-TACT-CTTCTGAGATTTGGCC-3'；外显子10，扩增片段长度为155bp：P1 5'-TGAAGATCTACATCACAG-TCCGAA-3',P2 5'-GAGAGGCTTGTTCAGAAT-TGCTG-3'。

　　4.PCR反应：首先用S引物进行扩增，将相应反应成分混合后，94℃预变性5 min，94℃ 50s，52℃ 50s，72℃ 50s，共循环38次，循环完成后72℃延伸7 min，然后取0.5～1.0 μl上述S引物扩增产物作为模板，用P引物扩增，94℃预变性5 min，94℃ 50s，62℃ 50s，72℃ 50s，共循环35次，循环完成后72℃延伸7 min，用2%琼脂糖电泳观察PCR产物扩增情况，如在相应位置有清晰扩增带，则可进行下一步的单链构象多态性(SSCP)电泳分析。

　　5.SSCP分析：采用10%的甘油聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压200V，恒温8℃，电泳4～6小时。

　　SSCP结果判断：每次电泳都以正常甲状腺组织扩增产物作为对照，若同时电泳的肿瘤标本与正常相比，出现条带增多、减少或位置变动即说明存在变异。每份标本均保证至少2次以上的PCR扩增和SSCP分析。

　　6.DNA测序：扩增产物用DNA纯化试剂盒纯化回收。采用ABI 377型PCR自动测序仪测序，计算机判读碱基序列。

结　　果

　　一、PCR-SSCP筛查的TSHR基因变异

　　在14例AFTA的石蜡包埋组织中检出了3例具有相同SSCP电泳条带变异的标本，表现为电泳条带增多，即正常为4条带，变异者为5条带(图1)。而4例新鲜外科手术标本中发现了两种不同的SSCP电泳条带改变，正常为4条带，一种变异为2条带，另一种变异为3条带(图2)。共计发现6例带型有变异的个体，均为自主性功能性甲状腺腺瘤，占43%(6/14)，腺瘤周围正常甲状腺组织及其余对照均未发现变异。

　　二、突变的位置和性质

　　对新鲜手术标本中PCR-SSCP检测有变异的3例、未发现变异的1例TMG和1例肿瘤周围正常甲状腺组织，共计5例标本测序，结果发现3例变异标本中1例为点突变，第620位密码子的第一碱基，即第1957位核苷酸发生A→C转换，使该密码子由

　　DS：双链DNA Double-strand DNA; M：pGEN-7Zf(+)/HaeⅢ Marker; n:正常带型 Normal individual; W:异常带型 Abnormal individual

图1　石蜡包埋标本PCR-SSCP分析结果(银染法)

　　Fig 1　PCR-SSCP profiles of specimens from paraffin-embeded tissue (silver staining)

　　n:正常带型 Normal individual; WW'：异常带型 Abnormal individual; DS：双链DNA Double-strand DNA; M：pGEN-7Zf(+)/HaeⅢ Marker； 其中W为测序确认有插入突变个体，W'为点突变个体标本1，2，3，4和5 PCR后测序。标本3在核苷第1957位确定有点突变(A→C)，标本2，3在核苷酸第1972与1973位之间有插入突变 Sample 1、2、3、4 and 5 were sequenced after PCR. Among them Sample 3 was identified as point mutation at nucleotide 1957 (A to C), Sample 2 and 5 were identified as insertion mutation between nucleotide 1972 and 1973

图2　新鲜组织SSCP分析结果

　　Fig 2　PCR-SSCP prafiles of fresh surgical tissue specimens (silver staining)

　　ACC突变为CCC，苏氨酸被脯氨酸置换(T620P)。2例突变性质相同，在1972与1973位核苷酸之间插入了一个腺嘌呤核苷酸(A)，使得密码子624位以后的氨基酸发生了移码突变。另外2例在SSCP分析中带型无变异的标本，测序序列正常。

讨　　论

　　本研究结果证明在自主性功能性甲状腺腺瘤中存在TSHR的体细胞性突变，突变检出率为43%(6/14)。迄今为止的资料显示^〔1-9〕，所有与自主性功能性甲状腺腺瘤有关的TSHR突变多位于TSH受体第10外显子第6穿膜片段、第三胞内袢等所谓热点片段(hot spot)，本研究亦着眼于这一区域，PCR扩增长度为155bp，包含密码子602～654氨基酸序列。DNA测序发现一例620密码子的点突变，苏氨酸被脯氨酸置换(T620P)。日本学者也发现这一位点发生突变^〔4〕，但碱基置换不同(T620S，ACC→TCC)。

　　TSH与TSH受体相结合，通过腺苷酸环化酶—cAMP级联反应途径将信号传递至胞浆内第二信使cAMP，从而控制甲状腺细胞的分化、腺体的功能活动及生长。依赖TSH的cAMP调节级联反应系统的功能过强或过弱都将影响甲状腺功能及细胞增殖^{〔10，11〕}。已有的研究显示，在甲状腺肿瘤中，cAMP调节级联反应与恶性转化密切相关^〔12〕。在转基因小鼠模型的实验中^〔10〕发现，TSHR突变可使基础腺苷酸环化酶活力升高，是甲状腺滤泡细胞自主分泌功能形成的病理生理基础。Parma等^〔1〕利用PCR技术，对翻译TSHR氨基酸残基589至647位的AFTA组织基因片段进行扩增，用限制性内切酶消化，发现619位的门冬氨酸被甘氨酸替代(D619G)，而623位的丙氨酸被异亮氨酸置换(A623I)。DNA测序发现突变仅存在于AFTA腺瘤组织，而腺瘤周围正常组织相应DNA序列正常，故认为AFTA是体细胞性突变(somatic mutation)。Paschke等^〔2〕也发现2例TSHR基因片段发生了体细胞性突变，双链直接测序证实2个突变为623位的丙氨酸被缬氨酸(A623V)置换，632位的苏氨酸被异亮氨酸(T632I)置换。还有学者用不同的方法陆续发现了新的突变位点和突变氨基酸^〔3-9〕，特别是Parma等^〔9〕于1997年总结了以前研究后，对33例AFTA标本翻译整个TSHR基因序列，分成14个片段PCR扩增后直接测序，发现27例TSHR基因突变(81%)，其中26例为点突变，1例为缺失突变。归纳起来，AFTA已发现的突变位点有20多个，以第6穿膜片段，第3胞浆袢突变频率最高。将含有上述突变位点的TSH受体的cDNA转染COS-7细胞，CHO细胞，FRTL-5细胞后，细胞内cAMP水平明显高于野生型TSH受体cDNA转染的细胞，突变的受体可使cAMP在胞浆内聚积，表明TSHR突变后可使cAMP级联反应通路持续激活，进而形成AFTA。

　　从目前的报道来看，不是每一例都发现突变，报道的检出率出入较大，在3%～81%之间。本研究发现其突变频率为43%。这些结果差异较大可能的原因有：(1)研究方法学的影响，不同的实验方法对突变检出的敏感性有差别；(2)样本选择偏倚；(3)与检测片段的长度和部位有关，截止目前的研究都限于TSHR基因的第10外显子，集中在第1、2胞外袢，第3胞内袢，第6、7穿膜段等所谓“热点”片段，而对基因的其余片段研究较少，不排除这些片段突变的可能。PCR扩增片段长度不一，难免遗漏可能突变的基因片段；(4)除TSH受体突变外，cAMP级联反应通路上的其他因素，如G蛋白突变也可能与本病发病有关^{〔13，14〕}。

　　本研究首次发现2例患者AFTA病变组织TSHR基因存在单碱基插入突变，在1972与1973位核苷酸之间插入了一个腺嘌呤核苷酸(A)，使得密码子624位以后的氨基酸发生了移码突变。这一突变仍处于TSHR突变的热点片段——第三胞内袢。有研究显示，此区域在cAMP信息传导上起着重要作用，其跨膜片段近边缘处的主要氨基酸残基突变，可以改变跨膜片段插入细胞膜的方式，从而影响整个受体结构。发生于第三胞内袢的任何改变都可使TSHR-cAMP处于持续激活状态^〔15〕。故我们认为单碱基插入突变同样可能在自主性功能性甲状腺腺瘤的发病中起着重要作用。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570674)

　　何岚（710061 西安医科大学第一附属医院内分泌科）

　　马秀萍（710061 西安医科大学第一附属医院内分泌科）

　　高慧（710061 西安医科大学第一附属医院内分泌科）

　　袁育康（西安医科大学免疫学教研室）

　　徐莉（710061 西安医科大学第一附属医院内分泌科）

参　考　文　献

　　1，Parma J, Duprez L, Van Sande J, et al. Somatic mutations in the thyrotropin receptor gene cause hyperfunctioning thyroid adenomas. Nature, 1993,365:649-651.

　　2，Paschke R, Tonacchera M, Van Sande J, et al. Identification and functional characterization of two new somatic mutations causing constitutive activation of the thyrotropin receptor in hyperfunctioning autonomous adenomas of the thyroid. J Clin Endocrinol Metab, 1994,79:1785-1789.

　　3，Porcillini A, Ciullo I, Laviola L, et al. Novel mutations of thyrotropin receptor gene in thyroid hyperfunctioning adenomas: rapid identification by fine needle aspiration biopsy. J Clin Endocrinol Metab, 1994,79:657-661.

　　4，Takeshita A, Nagayama Y, Yokoyama N, et al. Rarity of oncogenic mutations in the thyrotropin receptor of autonomously functioning thyroid nodules in Japan. J Clin Endocrinol Metab, 1995,80:2607-2611.

　　5，Russo D, Arturi F, Wicker R, et al. Genetic alterations in thyroid hyperfunctioning adenomas. J Clin Endocrinol Metab, 1995,80:1347-1351.

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　　12，Bishop JM. The molecular genetic of cancer. Science, 1987,235:305-311.

　　13，施秉银， 马秀萍， 主编. 现代甲状腺疾病诊断与治疗. 西安： 陕西科技出版社， 1998.117-123.

　　14，Parma J, Duprez L, Van Sande J, et al. Diversity and prevalence of somatic mutations in the thyrotropin receptor and Gsa genes as a cause of toxic thyroid adenomas. J Clin Endocrinol Metab, 1997,82:2695-2701.

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(收稿日期：1999-10-29)