雷公藤对哮喘豚鼠IL-5、GM-CSF基因转录的影响及作用机制

中国免疫学杂志 2000年第6期第16卷 中医中药与免疫

作者：林科雄　王长征　钱桂生

单位：林科雄（第三军医大学新桥医院呼吸内科研究所，重庆 400037）；王长征（第三军医大学新桥医院呼吸内科研究所，重庆 400037）；钱桂生（第三军医大学新桥医院呼吸内科研究所，重庆 400037）

关键词：雷公藤；哮喘；细胞因子；活化蛋白-1

　　摘　要　目的:探讨雷公藤对哮喘IL-5、GM-CSF基因转录的影响及其机制。 方法：采用卵蛋白（OA）致敏复制哮喘豚鼠模型，用原位杂交（ISH）就雷公藤甲素（TP）对其肺组织和外周血单个核细胞（PBMC）IL-5、GM-CSFmRNA表达的影响进行检测。并通过凝胶电泳迁移试验（EMSA）检测TP对伴刀豆蛋白（ConA）或佛波脂（PMA）刺激的人T细胞活化蛋白-1（AP-1）的DNA结合活性的影响。 结果：①哮喘豚鼠肺组织和PBMC IL-5、GM-CSFmRNA表达显著高于正常组（P＜0.01）和TP处理组（P＜0.05或0.01）。②ConA或PMA刺激可使T细胞AP-1的DNA结合活性增强， TP可以降低该AP-1的DNA结合活性。 结论：雷公藤通过抑制AP-1的DNA结合活性，进而抑制IL-5、GM-CSFmRNA的转录，是其治疗哮喘的机制之一。

　　中国图书分类号　R91

T.Wilfordii Hook.f. inhibits expressions of IL-5 and GM-CSF by suppression activator protein-1 activities

LIN Ke-Xiong,WANG Chang-Zheng, QIAN Gui-Sheng

　　（Department of Respiratory Diseases,Xinqiao Hospital, Third Military Medical University,Chongqing 400037）

　　Abstract　Objective:To investigate the effects and mechanisms of T.Wilfordii Hook.f. on the expressions of IL-5、GM-CSF of asthma .Methods:The allergic guinea pigs were induced by ovalbumin(OA). IL-5 and GM-CSF mRNA expressions in lung tissue and peripheral blood mononuclear cells (PBMC )of allergic guinea pigs were detected by in situ hybridization. At the same time,The effects of triptolide on DNA-binding activities of activator protein-1(AP-1) of human T cells stimulated by Concanavalin A(ConA) or Phorbol myristate acetate(PMA) were detected by electropheretic mobility shift assay(EMSA).Results:①By comparing with the normal controls, the expressions of IL-5, GM-CSF mRNA in lung tissue and PBMC of allergic guinea pigs were significantly higher. Treatment with triptolide could markedly inhibit IL-5, GM-CSF mRNA expressions(P＜0.05 or P＜0.01).②Triptolide could inhibit AP-1 DNA-binding activities of T cells stimulated with ConA or PMA.Conclusion:One mechanism of T.Wilfordii Hook.f. for asthma therapy is its inhibition on transcription of IL-5 and GM-CSF genes by inhibition on activities of NF-κB.

　　Key words　T.Wilfordii Hook.f.　Asthma　Cytokines　Activator protein-1

　　支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞（EOS）、肥大细胞和T细胞等多种炎症细胞参与的气道慢性炎症。EOS是造成气道粘膜损伤的主要效应细胞。IL-3、IL-5和GM-CSF是哮喘EOS增多和活化的关键调节因素。因此针对细胞因子的治疗是哮喘治疗的关键之一。雷公藤是卫茅科植物，具有抗炎及免疫抑制作用，广泛用于支气管哮喘、肾病综合征以及类风湿关节炎等的治疗^［1］。但其作用机制尚不完全清楚。本研究通过对哮喘肺组织和PBMC IL-5、GM-CSFmRNA和人外周血T细胞AP-1的DNA结合活性进行检测，探讨雷公藤对哮喘IL-5、GM-CSF基因转录的影响及其机制。

　　1　材料与方法

　　1.1　主要试剂　雷公藤甲素为福建中医药研究所产品。DEPC、蛋白酶K和Poly(dI-dC)均为宝灵曼公司产品。淋巴细胞分离液为上海试剂二厂产品。［γ-³²P］ATP为北京亚辉生物工程公司产品。无血清RPMI1640培养液（Gibco公司产品）含青、链霉素各100 U/ml。伴刀豆蛋白（ConA）和佛波脂（PMA）均为Sigma 公司产品。

　　1.2　哮喘豚鼠模型的制备　体重400～500 g豚鼠，雌雄不分。动物分为正常对照组、哮喘组、TP处理组，每组6只。采用卵蛋白（OA）致敏和激发建立豚鼠哮喘模型。即第1天腹腔内注射2%OA氢氧化铝凝胶1 ml致敏豚鼠，第8天重复注射加强致敏，第21天吸入2%OA生理盐水激发哮喘发作，吸入前腹腔内注射苯海拉明5 mg/kg体重。对照组以生理盐水代替2%OA，其余步骤不变。TP处理组分别在激发24 h后腹腔内按每kg体重注射TP 40 μg。

　　1.3　哮喘豚鼠外周血单个核细胞分离及肺组织取材　正常组和哮喘组豚鼠激发48 h后，TP处理组于用药24 h后，用3%戊巴比妥钠1 ml/kg体重腹腔内注射麻醉豚鼠，然后从颈动脉插管抽取外周血，用肝素抗凝，用淋巴细胞分离液的密度梯度离心分离PBMC、涂片（载玻片预先用多聚赖氨酸处理），4%PFA固定30 min。打开胸腔，钳夹主动脉，从右心室切一小口，经左心室插管注入0.01 mol/L PBS逆流灌注肺组织，直至右室流出清亮液体。再以4%PFA缓慢灌注肺组织。取右肺中叶肺组织4～5块固定于盛有4%PFA密闭容器中固定过夜，用于冰冻切片。

　　1.4　原位杂交（ISH）　IL-5、GM-CSF寡核苷酸探针由上海细胞生物所合成。其序列如下：IL-5 3′ˊCAC TCG GTG TTC ATT ACA CCA AGA AAC TCT, GM-CSF 3'CTG GAC TGG CTC CCA GCA GTC。寡核苷酸探针地高辛（Dig）标记采用3'末端转移法。所有杂交用器皿均严格按无RNAase方法处理。细胞涂片ISH的主要步骤如下：0.3% Triton X-100通透10 min，PBS漂洗，0.1 mol/L甘氨酸漂洗5 min，4%PFA固定5 min， PBS漂洗，0.25%（V/V）乙酸酐/0.1 mol/L三乙醇胺漂洗10 min，2×SSC 37℃漂洗10 min,加探针杂交液后置湿盒内42℃孵育过夜，系列SSC漂洗，4%PFA固定10 min，TSM1漂洗10 min，加碱性磷酸酶标记的抗- Dig抗体，置湿盒内37℃孵育1 h后转入4℃反应 20 h，TSM1、TSM2漂洗，NBT/BCIP显色。组织切片ISH的主要步骤如下：除在0.1 mol/L甘氨酸漂洗之前加用蛋白酶K（2 μg/ml）37℃消化20 min外，其余步骤同细胞涂片。本实验设置两种阴性对照：①杂交前用100 μg/ml RNAase 37℃预处理组织、细胞1 h；②加未标记的探针进行反应。其余步骤与加标记探针的样本相同。 结果判定：在高倍光学显微镜下(10×40)任取5个视野，计数平均每个视野肺组织ISH阳性细胞数。任取视野计数200个细胞以上计算PBMC ISH阳性细胞百分率。

　　1.5　T细胞核蛋白的提取　抽取正常健康志愿者外周血，按上述方法分离PBMC后，用过尼龙纤维柱分离T细胞。T细胞的纯度鉴定用免疫细胞化学S-AP法，其纯度均＞95%。分离后的T细胞用无血清RPMI 1640培养液重悬。以每孔3×10⁶细胞培养于96孔平底培养板，总体积200 μl，相应孔中加入ConA至终浓度25 μg/ml或加入PMA至终浓度50 ng/ml，相应孔中加入TP至10^-5mol/L，置于37℃，5%CO₂孵箱，2 h后收集。收集后的细胞重悬于400 μl裂解液A中（10 mmol/L HEPES,pH7.9,10 mmol/L KCl,0.1 mmol/L EGTA,0.1 mmol/L EDTA,1 mmol/L DTT,0.5 mmol/L PMSF）, ,冰浴15 min,加10%NP-40 25 μl,涡旋10 s, 4℃，13 000 r/min离心10 s，弃上清。沉淀加裂解液C（20 mmol/L HEPES,pH7.9,400 mmol/L NaCl,1 mmol/L EGTA,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L DTT,1 mmol/L PMSF）50 μl,冰浴30 min后,涡旋15～30 s,4℃ 12 000 r/min离心5 min,上清即为核蛋白^［2］。核提取物蛋白浓度用Bradford 法测定。

　　1.6　凝胶电泳迁移试验(EMSA）　 EMSA参照文献方法进行^［2］，AP-1双链核苷酸探针由上海细胞生物所合成,序列如下：

　　P1 5'-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3'，

　　P2 3'- AAC TAC TCA GTC GGC CTT TGC-5'。

　　采用T4多核苷酸激酶法以［γ-³² P］ATP(放射性比浓度10 mCi/ml）标记探针。DNA结合反应体系为：DNA结合反应缓冲液［1 mmol/L Tris-HCl，pH8.0,1mmol/L NaCl, 0.5 mmol/L EDTA，pH 8.0,1 mmol/L DTT0.5 μl,1 mmol/L MgCl₂,20%甘油, 1 μg/μl Poly(dI-dC)1 μl］,总体积20 μl,加已标记AP-1探针2 μl(1 ng)，待测标本样品(核提取物) 3 μg，25～30℃水浴30 min 后加上样缓冲液4 μl混匀，反应产物经6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，电泳完毕后干胶，-70℃放射自显影3 h。

　　1.7　统计与分析　ISH结果以±s%表示，采用t检验和方差分析。P＜0.05为相差显著。

　　2　结果

　　2.1　TP对哮喘豚鼠肺组织IL-5、GM-CSF mRNA的影响　光学显微镜下见表达IL-5、GM-CSF mRNA的细胞被染成紫蓝色，染色部分位于胞浆。哮喘组可见IL-5、GM-CSF mRNA表达较正常组显著增加(P＜0.01),TP处理后IL-5、GM-CSF mRNA表达减弱（P＜0.05）。结果见图1。

图1　肺组织IL-5、GM-CSF mRNA表达

　　Fig.1　Expression of IL-5,GM-CSF mRNA in lung tissue

　　Note:* P＜0.01 compared with normal control, △ P＜0.05 compared with allergic group

　　2.2　TP对哮喘豚鼠PBMC IL-5、GM-CSF mRNA表达的影响　光学显微镜下观察，可见正常豚鼠外周血PBMC表达IL-5、GM-CSF mRNA较弱，部分甚至完全无表达，哮喘豚鼠PBMC表达IL-5、GM-CSF mRNA显著增加（P＜0.01），TP处理后IL-5、GM-CSF mRNA表达减弱（P＜0.01）。结果见图2。

图2　外周血PBMC IL-5、GM-CSF mRNA表达

　　Fig.2　Expressions of IL-5,GM-CSF mRNA in PBMC

　　Note:* P＜0.01 compared with normal control, △ P＜0.01 compared with allergic group

　　2.3　AP-1 EMSA 检测结果　在无干预条件下正常人T细胞AP-1活性较弱，经ConA或PMA刺激后其活性显著增加，经ConA或PMA处理的细胞同时加入TP处理后，AP-1的活性较单纯ConA或PMA处理明显减弱。竞争抑制试验可见AP-1活性受抑制。结果见图3、图4。

图3　AP-1 EMSA检测结果

　　Fig.3　The activities of AP-1 detected by EMSA

　　Note: lane1:PMA+TP,lane2:ConA,lane3:PMA,lane4:ConA,lane5:control

图4　AP-1竞争抑制试验结果

　　Fig.4　Competitive inhibition experiments of AP-1

　　Note:lane1:ConA，lane2:100 times unlabeled probes，lane3:200 times unlabeled probes

　　3　讨论

　　变应原引起的迟发性反应的皮肤中有IL-3、IL-5、GM-CSF mRNA表达^［3］。与此类似，特应性哮喘患者BALF细胞中表达IL-5、IL-4、IL-3、GM-CSF mRNA的细胞数增多，其阳性细胞百分率与哮喘严重程度和气道高反应性(BHR)密切相关^［4］。另外，哮喘加重期患者外周血中表达IL-3、IL-4、IL-5、GM-CSFmRNA的CD4⁺T细胞(而不是CD8⁺T淋巴细胞)百分率较对照组增加^［5］。我们通过ISH证实，哮喘豚鼠肺组织和PBMC IL-5和GM-CSFmRNA表达增加，与上述研究一致。细胞因子IL-5、IL-3、GM-CSF不仅能促进EOS生成、活化、成熟、存活延长，而且也能促进EOS气道内聚集。而后者通过释放多种炎性介质如：碱性蛋白、白三烯（LT）、血小板活化因子（PAF）等，引起气道上皮损伤、气道收缩、炎症细胞浸润以及气道高反应性等^［5］。因此，细胞因子IL-5、 IL-3、GM-CSF 在哮喘的发病中起重要作用。我们过去的研究证实，雷公藤能减轻哮喘症状、改善患者肺功能、降低EOS活力和气道高反应性^［6，7］。本文研究表明，TP能抑制哮喘豚鼠肺组织和PBMC IL-5和GM-CSF mRNA表达，可能是雷公藤发挥上述作用的重要机制。

　　细胞因子主要在转录水平被调节，转录因子通过与相应细胞因子启动子或增强子的DNA序列结合，对基因的转录起重要调节作用。 AP-1是一重要的转录因子，它是由Fos (C-Fos、FosB和Fral)和Jun（C-Jun、Jun D和Jun B）家族形成的二聚体，参与多种与哮喘有关的细胞因子如IL-4、IL-5、GM-CSF等的基因转录^［2,8］。在活化的T细胞中，C-Fos和Jun B是AP-1复合物最普遍的存在方式。AP-1的DNA结合活性被PKC活化剂尤其是PMA活化，并通过以下途径调节基因转录^［9］：①直接通过与相应DNA结合序列结合活化相应基因；②通过与相应DNA结合序列结合并与其他转录因子（如NF-AT）协同调节基因转录；③不依赖于相应DNA结合序列，与其他转录因子协同调节基因转录。本文结果发现ConA和PMA均能诱导AP-1的DNA结合活性，TP能抑制ConA或PMA诱导的AP-1 DNA结合活性。由于AP-1参与IL-5、GM-CSF等基因的转录调控^［2,8］。因此，雷公藤通过抑制AP-1 DNA结合活性，进而抑制IL-5和GM-CSF等的基因转录，可能是雷公藤抑制IL-5、GM-CSF等前炎症细胞因子基因转录的重要分子机制。

　　国家自然基金资助项目，批准号：39870946

　　作者简介：林科雄，男，呼吸专业硕士

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1999-08-08

1999-12-17