糖皮质激素及茶碱对哮喘小鼠气道炎症与肺内一氧化氮抑制作用的研究
中华结核和呼吸感染 1998年第11期第0卷 论著
作者：余兵 何权瀛 高占成 丁东杰 何冰
单位：100044 北京 北京医科大学人民医院呼吸科(余兵、何权瀛、高占成、丁东杰)；北京医科大学第一附属医院呼吸科(何冰)
关键词： 哮喘；一氧化氮；诱生型一氧化氮合酶；糖皮质激素；茶碱
【摘要】 目的 探讨糖皮质激素、茶碱对哮喘气道炎症和肺内一氧化氮(NO)水平、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响。方法 BALB/c小鼠分为6组：哮喘模型组(A，10只)，正常对照组(N，10只)，地塞米松雾化吸入组(C1，7只)，地塞米松腹腔注射组(C2，7只)，布地奈德气雾剂组(C3，7只)，茶碱组(T，10只)。建立哮喘模型，给予糖皮质激素、氨茶碱，观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数、嗜酸性粒细胞百分比(EOS%)、总蛋白水平及NO水平的变化，用NADPHd组化法和iNOS免疫组化法观察肺组织内iNOS定位及表达情况。结果 哮喘组BALF中白细胞总数(10.64±0.75)×107/L、EOS%(12.55%±7.64%)、总蛋白含量(0.124±0.080 g/L)和NO水平(5.00±1.87 μmol/L)与正常对照组比较，差异有显著性(P＜0.001)，各指标数值分别为［(3.15±0.92)×107/L，0.02%±0.04%，0.008±0.004 g/L，1.30±0.67 μmol/L］；肺内支气管上皮细胞iNOS表达增加；给予糖皮质激素后BALF中白细胞总数、EOS%总蛋白含量指标C1：(5.05±1.14)×107/L，0.10%±0.06%，0.016±0.011 g/L，1.20±0.97 μmol/L；C2：(5.47±0.59)×107/L，0.10%±0.08%，0.010±0.008 g/L；C3：(6.53±0.47)×107/L，0.24%±0.33%，0.020±0.012 g/L与哮喘组比较，差异有显著性(P＜0.001～0.05)，细胞内iNOS表达减弱；给予茶碱后明显抑制炎症，上述各项指标分别为［(3.65±1.04)×107/L，2.84%±1.90%，0.012±0.008 g/L］，差异有显著性(P＜0.001～0.05)，但NO水平及iNOS表达无显著变化。结论 EOS是哮喘气道炎症主要效应细胞，NO可能参与哮喘气道炎症。糖皮质激素和茶碱可抑制哮喘气道炎症；糖皮质激素抑制哮喘时肺内NO的产生；而茶碱则作用不明显。
The role of glucocorticosteroid and theophylline in asthmatic inflammation of murine model and the inhibition in NO production in lung Yu Bing,He Quanying, Gao Zhancheng, et al. The Second Hospital of Beijing Medical University, Beijing,100044
【Abstract】 Objective To investigate the role of glucocorticosteroid and theophylline in treatment of asthmatic inflammation and their effects in production of nitric oxide (NO)and the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS).Method A murine model was set up (A group: asthma model, N group: control mice), then the number of WBC, eosinophils%(EOS), total protein level and the NO level in brochoalveolar lavage fluid(BALF) were measured after treatment with glucocorticosteroid (C1 group: dexamethason inhalation; C2 group: dexamethason peritoneal injection and C3 group: budisonide inhalation) and aminophylline(T group). The expression of iNOS was studied by histochemistry and immunohistochemistry.Result There was a significant increase in number of WBC ［(10.64±0.75)×107/L vs (3.15±0.92)×107/L， P＜0.001)，EOS% (12.55%±7.64% vs 0.02%±0.04%, P＜0.001),total protein level (0.124±0.080 g/L vs 0.008±0.004 g/L, P＜0.001) and concentration of NO (5.00±1.87 μmol/L vs 1.30±0.67 μmol/L，P＜0.001) in BALF after antigen challenge, and the expression of iNOS was increased in airway epithelial cells and alveolar macrophages. After administration of steroids and theophylline, the number of WBC［C1：(5.05±1.14)×107/L，C2：(5.47±0.59)×107/L，C3：(6.53±0.47)×107/L，T：(3.65%±1.04)×107/L，P＜0.001］，EOS%(C1:0.10%±0.06%，C2:0.10%±0.08%, C3:0.24%±0.33%，T：2.84%±1.90%， P＜0.001～0.005), total protein level (C1:0.016±0.011 g/L, C2: 0.010±0.008 g/L, C3: 0.020±0.012 g/L, T:0.012±0.008 g/L, P＜0.001～0.05) were significantly decreased. There was a significant reduction of NO level (C1:1.20±0.97 μmol/L, P＜0.001) and iNOS expression after treated with steroids, but no significant change after management with theophylline.Conclusion EOS is main inflammatary cell in asthma. NO may play an important role in aggravating asthma. Steroids and theophylline both can inhibit cell infiltration and serum protein leakage in asthma.Steroids can also inhibit the production of NO and iNOS expression. But theophylline has no significant effect in NO production in lung.
【Key words】 Asthma Eosinophils Nitric oxide Inducible nitric oxide synthase Glucocorticosteroid Theophylline
哮喘的本质是以嗜酸性粒细胞(EOS)、淋巴细胞等炎性细胞浸润的气道慢性非特异性炎症。近来研究发现，哮喘时呼出气中一氧化氮(NO)水平显著升高［1］，诱生型一氧化氮合酶(iNOS)在哮喘患者支气管上皮细胞［2］和肺泡巨噬细胞［3］内表达增加，认为NO可能参与哮喘气道炎症。糖皮质激素和茶碱均有抑制哮喘炎性细胞浸润［4，5］和降低肺内微血管渗漏［6，7］的作用。新近研究表明，糖皮质激素可抑制哮喘时肺内NO的产生［8］，茶碱是否对肺内NO的产生有影响，尚少有文献报告。我们建立小鼠哮喘模型，分别给予糖皮质激素、茶碱治疗，观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数、EOS%、总蛋白含量及NO水平，采用NADPHd组化法及iNOS免疫组化法观察iNOS定位和表达变化，旨在进一步阐明哮喘的发病机制和上述药物的作用机理。
材料与方法
1.实验动物分组：51只BALB/c雄性小鼠(体重20～25 g)随机分为以下6组：哮喘模型组(A，10只)，正常对照组(N，10只)，地塞米松雾化吸入组(C1，7只)；地塞米松腹腔注射组(C2,7只)，布地奈德气雾剂组(C3，7只)，茶碱组(T，10只)。
2.哮喘模型的建立：腹腔注射卵蛋白(GradeⅡ，Sigma)抗原液0.5 ml(含Al(OH)3 2 mg和卵蛋白15 μg)致敏，7天后重复注射1次。致敏后第14天，雾化吸入0.5%卵蛋白生理盐水液，每次1小时，2次/日，共3天。
3.给药方法：地塞米松雾化组：每次激发前1小时雾化吸入地塞米松0.2 g/L，共10分钟；地塞米松腹腔注射组：每次激发前1小时注射地塞米松0.2 mg/kg；布地奈德气雾剂组：每次激发前1小时，喷入布地奈德1 mg，保存10分钟，2次/日。茶碱组：每次激发前1小时，腹腔注射氨茶碱20 mg/kg，2次/日。
4.BALF白细胞总数和EOS%的检测：腹腔麻醉小鼠，气管插管，用PBS缓冲液1 ml灌洗双肺，回收灌洗液，反复3次，对BALF进行白细胞总数计数；离心制成涂片，伊红-美蓝染色，进行细胞分类计数。
5.BALF总蛋白含量和NO水平测定：(1)用总蛋白测定试剂盒(购自中生公司)中试剂与标本反应，721分光光度计测吸光度值，计算标本中总蛋白含量，以反映肺内微血管渗漏的情况。(2)使用一氧化氮试剂盒(购自军事医学科学院)中试剂与标本进行反应，721分光光度计测吸光度值，计算标本中NO2/NO3含量，以反应肺内NO的水平。
6.肺组织标本染色：(1)激发后72小时处死动物，取部分右肺进行HE染色，观察哮喘组肺组织炎性细胞浸润的情况。(2)取左肺经多聚甲醛磷酸缓冲液及20%蔗糖缓冲液处理后，冰冻切片，NADPHd组化染色：切片上滴加200 μl新鲜配制的反应液(10 ml含NADPH四钠盐10 mg，NBT 5 mg，Trition X-100 0.3 ml，用0.05 mol/L pH 8.0的Tris缓冲液配制)，室温条件下放置45～90分钟后，终止反应，光镜下观察染色情况。(3)剩余右肺制成石蜡切片，进行iNOS免疫组化染色：切片预处理及微波修复后，封闭非特异性抗原，加入1:150 iNOS多克隆抗体(一抗，购自Santa Cruz公司)室温下30～40分钟，顺序加入生物素化羊抗兔血清(二抗)及酶标链霉亲和素(三抗)，二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)显色，脱水、透明、封片，光镜下观察阳性染色情况。
7.统计学处理：各指标(计量资料)以
±
表示。各组实验数据均用SPSS统计软件进行方差分析及秩和检验处理。
结果
一、小鼠模型肺组织病理改变
哮喘组肺组织切片HE染色可见支气管及血管周围大量炎性细胞浸润，以EOS为主，肺间质及肺泡腔也可见EOS存在(图1～3)。
二、各组BALF中白细胞总数和细胞分类情况
哮喘组BALF中白细胞总数及EOS%均较正常对照组显著升高(P＜0.001)，经糖皮质激素和茶碱治疗后，白细胞总数及EOS%均较哮喘组显著下降(P＜0.001～0.05，表1)。
三、各组BALF中总蛋白含量及NO水平
哮喘组总蛋白及NO2/NO3含量均显著高于正常对照组(P＜0.001)，三组糖皮质激素总蛋白含量均显著低于哮喘组(P值分别为：C1：P＜0.001，C2：P＜0.001，C3：P＜0.05)，茶碱治疗组总蛋白含量显著低于哮喘组(P＜0.001)。吸入地塞米松可使NO水平显著下降(P＜0.001)，茶碱组NO水平虽有下降，但统计学处理差异无显著性(P＞0.05，表2)。
表1 各组BALF中的白细胞总数及EOS%的比较(±)
| 组别 |
只数 |
白细胞总数(107/L) |
嗜酸性粒细胞百分比(%) |
| A〓组 |
10 |
10.64±0.75 |
12.55±7.64 |
| N〓组 |
10 |
3.15±0.92△ |
0.02±0.04△ |
| C1组 |
7 |
5.05±1.14△▲ |
0.10±0.06△ |
| C2组 |
7 |
5.47±0.59△▲ |
0.10±0.08△ |
| C3组 |
7 |
6.53±0.47△▲ |
0.24±0.33△ |
| T〓组 |
10 |
3.65±1.04△ |
2.84±1.90▲ |
注：与哮喘组比较 P＜0.05，△P＜0.001，与正常对照组比较▲P＜0.05
表2 各组BALF中总蛋白含量和
含量的比较(±)
| 组别 |
只数 |
总蛋白含量(g/L) |
含量(μmol/L) |
| A组 |
10 |
0.124±0.080 |
5.00±1.87 |
| N组 |
10 |
0.008±0.004△ |
1.30±0.67△ |
| C1组 |
7 |
0.016±0.011△ |
1.20±0.97△ |
| C2组 |
7 |
0.010±0.008△ |
| C3组 |
7 |
0.020±0.012 |
| T组 |
10 |
0.012±0.008△ |
3.20±0.83▲ |
注：与哮喘组比较P＜0.05,△P＜0.001，与正常对照组比较▲ P＜0.001 四、肺组织NADPHd组化染色和iNOS免疫组化染色结果
NADPHd阳性染色呈蓝紫色，iNOS免疫组化染色呈棕色，本实验中两种染色方法结果较一致，阳性染色部位位于支气管上皮细胞浆内，巨噬细胞呈阳性染色。哮喘组光镜下观察阳性染色比正常对照组着色深，雾化吸入地塞米松后，着色较哮喘组浅，与正常组比较差异不多，茶碱组着色情况与哮喘组比较无明显差别(图4～11)。
图1 正常对照组肺组织 HE ×200
图2 哮喘模型组肺组织血管及支气管周围可见密集的炎性细胞 HE ×100
图3 哮喘模型组肺内血管旁大量EOS浸润 HE ×1000
图4 正常对照组支气管上皮细胞可见阳性染色，着色浅浓 NADPH ×400
图5 哮喘模型组支气管上皮细胞阳性染色，位于胞浆，着色较深 NADPH ×400
图6 激素组支气管上皮细胞染色阳性，着色较浅 NADPH ×400
图7 茶碱组支气管上皮细胞染色阳性 NADPH ×400
图8 哮喘模型组可见支气管上皮细胞染色阳性 免疫组化 ×400
图9 正常对照组支气管上皮细胞染色阳性，着色浅浓 免疫组化 ×400
图10 激素组支气管上皮细胞染色阳性 免疫组化 ×400
图11茶碱组支气管上皮细胞染色阳性 免疫组化 ×400
讨论
哮喘是以EOS浸润为主的慢性气道炎症，微血管渗漏增加，血浆蛋白渗出增多。本组研究显示，哮喘组BALF中白细胞总数、EOS%、总蛋白含量均显著高于正常对照组，大量EOS等炎性细胞聚集在支气管及肺血管周围，符合哮喘病理学的特点。糖皮质激素可抑制EOS、T淋巴细胞的趋化［4］，降低肺微血管的通透性［6］。我们采用三种不同途径给予不同剂型的激素，均可显著抑制EOS的肺内浸润，减少肺内血浆蛋白的渗漏，提示三种给药方法作用基本相同，近来发现茶碱具有抗炎、免疫调节和支气管保护作用［9］。茶碱可抑制EOS肺内浸润［5］，降低肺内微血管的渗漏。Nelson等［10］报告给予小鼠腹腔注射氨茶碱(20 mg/kg)后，1小时茶碱血浓度为11.5±0.9 μg/ml，4小时后血浓度＜0.3 μg/ml。本组实验中2次给药，推测血药浓度属较低范围，BALF中白细胞总数、EOS%、总蛋白含量均显著降低，提示低浓度茶碱具有抗炎作用。
目前认为NO参与许多病理生理过程，具有舒张支气管平滑肌，参与细胞免疫等功能。Kharitonov等［1］发现哮喘患者呼出气中NO水平升高，Hamid等［2］研究显示，哮喘时气道上皮细胞iNOS表达增加，肺泡巨噬细胞在炎性因子的作用下，NO含量增多［3］。Kharitonov等［8］认为生理情况下，肺内细胞中原生型一氧化氮合酶(cNOS)催化产生适量NO，维持支气管舒张状态；而哮喘炎症时，肺泡巨噬细胞、支气管上皮细胞中iNOS表达增加，大量NO产生，高浓度NO使血管通透性增加，粘膜充血，上皮细胞脱落，加重哮喘炎症，因而认为NO的作用具有双重性。我们的结果显示，哮喘时BALF中NO水平升高，支气管上皮细胞中iNOS表达增加，肺泡巨噬细胞内也有iNOS表达，提示气道内NO升高是由于上述两种细胞iNOS表达增加的结果，和近来国内研究报告相一致［11］，因此NO可能参与哮喘时气道炎症。
近来研究［8］显示，糖皮质激素可降低哮喘时呼出气中NO水平，阻止细胞因子诱导细胞内iNOS合成［12］，我们的结果显示，吸入地塞米松后，支气管上皮细胞iNOS表达受抑制，BALF中NO水平下降，提示气道内NO产量减少是由于iNOS表达降低所致。寻找一种能够特异性地抑制iNOS表达的药物，这种药物并不影响cNOS的活性，可能是治疗哮喘的希望所在。
茶碱对哮喘肺内NO是否有影响尚少有文献报道。我们的结果显示，茶碱组BALF中NO水平无显著下降，肺内细胞中iNOS表达无显著减弱，提示茶碱可能对肺内NO的产生无显著影响，本组研究关于茶碱对哮喘肺内NO的影响仅做了初步探讨，尚需临床研究及进一步的深入研究予以证实。
参 考 文 献
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(收稿：1998-01-04 修回：1998-05-30)
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